用于RNA向導的基因調節和編輯的正交Cas9蛋白的制作方法
【專利說明】用于RNA向導的基因調節和編輯的正交Cas9蛋白
[0001] 相關申請數據
[0002] 本申請要求于2013年7月10日提交的第61 /844,844號的美國臨時專利申請的優先 權,并且該申請的全部內容針對所有目的通過引用結合于此。
[0003] 政府權益聲明
[0004] 本發明在國立衛生研究院的授權號P50HG005550W及能源部的DE-FG02-02ER63445下獲得政府支持。政府對本發明享有一定權利。
【背景技術】
[0005] 細菌和古細菌(archaeal)CRISPR-Cas系統憑借與化S蛋白復合的短向導RNA引導 存在于侵襲外來核酸內的互補序列的降解。參見Deltcheva, E.et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small 民NA and host factor 民Nase III.Nature 471, 602-607(2011);Gasiunas,G?,Barrangou,R.,Horvath,P?&Siksnys,V?Cas9-crRNA ribonucIeoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109,E2579-2586(2012);Jinek,M.et al.A programmable dual-民NA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821(2012);Sapranauskas,R.et al.Ilie Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli.Nucleic acids research 39,9275-9282(2011);和趾aya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea:versatile small 民NAs for adaptive defense and regulation.Annual review of genetics 45,273-297(2011)。最近化賊性鏈球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系 統的體外重構證實了融合至通常反式編碼tracrRNAr反式激活的CRISPR RNA")的crRNA rCRISPR民歴")足^引導Cas9蛋白序列特異性裂解匹配crRNA的靴DNA序列。表達與靴位點 同源的gRNA導致Cas9的招募(recruitment)和革EDNA的降解。參見H.Deveau et al. ,Phage response to C民ISP民一encoded resistance in Streptococcus thermophiIus.Journal of Bacteriology 190,1390(Feb,2008)D
【發明內容】
[0006] 本公開的方面涉及向導RNA、DNA結合蛋白和雙鏈DNA靴序列的復合物。根據某些方 面,本公開范圍內的DNA結合蛋白包括與向導RNAW及與將復合物引導至雙鏈DNA序列的向 導RNA形成復合物的蛋白質,其中,復合物結合至DNA序列。本公開的該方面可W稱為RNA和 DNA結合蛋白至雙鏈DNA或與雙鏈DNA的共定位。臥這種方式,可?將DNA結合蛋白-向導RNA 復合物用于將轉錄調節蛋白或結構域定位于靴DNA處從而調節靴DNA的表達。根據一個方 面,兩個或更多個或多種正交RNA(o^hogonal RNA)向導的DNA結合蛋白或一組正交RNA向 導的DNA結合蛋白可用于同時和獨立調節細胞中DNA中的基因。根據一個方面,兩個或更多 個或多種正交RNA向導的DNA結合蛋白或一組正交RNA向導的DNA結合蛋白可用于同時和獨 立編輯細胞中DNA中的基因。應當理解的是,在引用DNA結合蛋白或RNA向導的DNA結合蛋白 時,運種引用包括正交DNA結合蛋白或正交RNA向導的DNA結合蛋白。運種正交DNA結合蛋白 或正交RNA向導的DNA結合蛋白可W具有核酸酶活性,它們可W具有切口酶(nickase)活性 或它們可W是核酸酶無效的(nuclease null)。
[0007] 根據某些方面,提供了調控細胞中祀核酸的表達的方法,該方法包括將編碼互補 于DNA(脫氧核糖核酸)的一種或多種RNA(核糖核酸)的第一外來核酸(foreign nucleic acid)引入至細胞中,其中,DNA包括祀核酸,將編碼結合至DNA并由一種或多種RNA向導的 RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白(nuclease-null DNA binding protein)的第二外來核 酸引入至細胞中,將編碼轉錄調節蛋白或結構域的第=外來核酸引入至細胞中,其中,一種 或多種RNA、RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白和轉錄調節蛋白或結構域表達,其中,一種 或多種RNA、RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白和轉錄調節蛋白或結構域共定位至DNA,并 且其中,轉錄調節蛋白或結構域調節祀核酸的表達。
[0008] 根據一個方面,編碼RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的外來核酸進一步編碼融 合至RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的轉錄調節蛋白或結構域。根據一個方面,編碼一 種或多種RNA的外來核酸進一步編碼RNA結合結構域的祀并且編碼轉錄調節蛋白或結構域 的外來核酸進一步編碼融合至轉錄調節蛋白或結構域的RNA結合結構域。
[0009] 根據一個方面,細胞是真核細胞。根據一個方面,細胞是酵母細胞、植物細胞或動 物細胞。根據一個方面,細胞是哺乳動物細胞。
[0010] 根據一個方面,RNA在約10至約500個核巧酸之間。根據一個方面,RNA在約20至約 100個核巧酸之間。
[0011]根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域是轉錄激活因子(transcriptional activator)。根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域上調祀核酸的表達。根據一個方面,轉 錄調節蛋白或結構域上調祀核酸的表達W治療疾病或有害狀況(d e t r i m e n t a 1 condition)。根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。根據一個方面,轉錄調節蛋白 或結構域是轉錄抑制因子(transcriptional repressor)。根據一個方面,轉錄調節蛋白或 結構域下調祀核酸的表達。根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域下調祀核酸的表達W治 療疾病或有害狀況。根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。
[0012]根據一個方面,一種或多種RNA是向導RNA(guide RNA)。根據一個方面,一種或多 種 RNA 是 tracrRNA-crRNA 融合體。
[0013 ] 根據一個方面,DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源DNA。
[0014]根據某些方面,提供了調控(modulate)細胞中的祀核酸的表達的方法,包括將編 碼互補于DNA(脫氧核糖核酸)的一種或多種RNA(核糖核酸)的第一外來核酸引入至細胞中, 其中,DNA包括祀核酸,將編碼II型CRISPR系統的RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白(結合 至DNA并由一種或多種RNA向導)的第二外來核酸引入至細胞中,將編碼轉錄調節蛋白或結 構域的第立外來核酸引入至細胞中,其中,一種或多種RNA、II型CRISPR系統的RNA向導的核 酸酶無效DNA結合蛋白和轉錄調節蛋白或結構域表達,其中,一種或多種RNA、II型CRISPR系 統的RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白和轉錄調節蛋白或結構域共定位至DNA,并且其中, 轉錄調節蛋白或結構域調節祀核酸的表達。
[00巧]根據一個方面,編碼II型CRISPR系統的RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的外來 核酸進一步編碼融合至II型CRISPR系統的RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的轉錄調節 蛋白或結構域。根據一個方面,編碼一種或多種RNA的外來核酸進一步編碼RNA結合結構域 的祀并且編碼轉錄調節蛋白或結構域的外來核酸進一步編碼融合至轉錄調節蛋白或結構 域的RNA結合結構域。
[0016] 根據一個方面,細胞是真核細胞。根據一個方面,細胞是酵母細胞、植物細胞或動 物細胞。根據一個方面,細胞是哺乳動物細胞。
[0017] 根據一個方面,RNA在約10至約500個核巧酸之間。根據一個方面,RNA在約20至約 100個核巧酸之間。
[0018] 根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域是轉錄激活因子。根據一個方面,轉錄調節 蛋白或結構域上調祀核酸的表達。根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域上調祀核酸的表 達W治療疾病或有害狀況。根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。
[0019]根據一個方面,一種或多種RNA是向導RNA。根據一個方面,一種或多種RNA是 tracrRNA-crRNA 融合體。
[0020] 根據一個方面,DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源DNA。
[0021] 根據某些方面,提供了調控細胞中祀核酸的表達的方法,包括將編碼互補于DNA (脫氧核糖核酸)的一種或多種RNA (核糖核酸)的第一外來核酸引入至細胞中,其中,DNA包 括祀核酸,將編碼結合至DNA并由一種或多種RNA向導的核酸酶無效化s9蛋白的第二外來核 酸引入至細胞中,將編碼轉錄調節蛋白或結構域的第=外來核酸引入至細胞中,其中,一種 或多種RNA、核酸酶無效化s9蛋白和轉錄調節蛋白或結構域表達,其中,一種或多種RNA、核 酸酶無效Cas9蛋白和轉錄調節蛋白或結構域共定位至DNA,并且其中,轉錄調節蛋白或結構 域調節祀核酸的表達。
[0022] 根據一個方面,編碼核酸酶無效化s9蛋白的外來核酸進一步編碼融合至核酸酶無 效化s9蛋白的轉錄調節蛋白或結構域。根據一個方面,編碼一種或多種RNA的外來核酸進一 步編碼RNA結合結構域的祀并且編碼轉錄調節蛋白或結構域的外來核酸進一步編碼融合至 轉錄調節蛋白或結構域的RNA結合結構域。
[0023] 根據一個方面,細胞是真核細胞。根據一個方面,細胞是酵母細胞、植物細胞或動 物細胞。根據一個方面,細胞是哺乳動物細胞。
[0024] 根據一個方面,RNA在約10至約500個核巧酸之間。根據一個方面,RNA在約20至約 100個核巧酸之間。
[0025] 根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域是轉錄激活因子。根據一個方面,轉錄調節 蛋白或結構域上調祀核酸的表達。根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域上調祀核酸的表 達W治療疾病或有害狀況。根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。
[002引根據一個方面,一種或多種RNA是向導RNA。根據一個方面,一種或多種RNA是 tracrRNA-crRNA 融合體。
[0027] 根據一個方面,DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源DNA。
[00%]根據一個方面,提供了包含W下的細胞:編碼互補于DNA的一種或多種RNA的第一 外來核酸,其中,該DNA包括祀核酸,編碼RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的第二外來核 酸,和編碼轉錄調節蛋白或結構域的第=外來核酸,其中,一種或多種RNA、RNA向導的核酸 酶無效DNA結合蛋白和轉錄調節蛋白或結構域是用于祀核酸的共定位復合物(CO- localization complex)的成員。
[0029] 根據一個方面,編碼RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的外來核酸進一步編碼融 合至RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白的轉錄調節蛋白或結構域。根據一個方面,編碼一 種或多種RNA的外來核酸進一步編碼RNA結合結構域的祀并且編碼轉錄調節蛋白或結構域 的外來核酸進一步編碼融合至轉錄調節蛋白或結構域的RNA結合結構域。
[0030] 根據一個方面,細胞是真核細胞。根據一個方面,細胞是酵母細胞、植物細胞或動 物細胞。根據一個方面,細胞是哺乳動物細胞。
[0031] 根據一個方面,RNA在約10至約500個核巧酸之間。根據一個方面,RNA在約20至約 100個核巧酸之間。
[0032] 根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域是轉錄激活因子。根據一個方面,轉錄調節 蛋白或結構域上調祀核酸的表達。根據一個方面,轉錄調節蛋白或結構域上調祀核酸的表 達W治療疾病或有害狀況。根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。
[0033]根據一個方面,一種或多種RNA是向導RNA。根據一個方面,一種或多種RNA是 tracrRNA-crRNA 融合體。
[0034] 根據一個方面,DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源DNA。
[00對根據某些方面,RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白是II型CRISPR系統的RNA向導 的核酸酶無效DNA結合蛋白。根據某些方面,RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白是核酸酶無 效化s9蛋白。
[0036] 根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,包括將編碼兩種或更多種 RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸的相鄰位點,將編碼至少一種 RNA向導的DNA結合蛋白切口酶的第二外來核酸引入至細胞中,該DNA結合蛋白切口酶可W 是正交RNA向導的DNA結合蛋白切口酶并且由兩種或更多種RNA向導,其中,兩種或更多種 RNA和至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶表達,并且其中,至少一種RNA向導的DNA結合 蛋白切口酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切割(nick)DNA祀核酸,得到兩個或 更多個相鄰的切口。
[0037] 根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,其包括將編碼兩種或更多 種RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸中的相鄰位點,將編碼II型 CRISPR系統的至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶(由兩種或更多種RNA向導)的第二外 來核酸引入至細胞中,其中,兩種或更多種RNA和II型CRISPR系統的至少一種RNA向導的DNA 結合蛋白切口酶表達,并且其中,II型CRISPR系統的至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口 酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切割DNA祀核酸,得到兩個或更多個相鄰切口。
[0038] 根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,其包括將編碼兩種或更多 種RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸中的相鄰位點,將編碼具有 一個非活性(inactive)核酸酶結構域并由兩種或更多種RNA向導的至少一種化s9蛋白切口 酶的第二外來核酸引入至細胞中,其中,兩種或更多種RNA和至少一種Cas9蛋白切口酶表 達,并且其中,該至少一種化s9蛋白切口酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切割 DNA祀核酸,得到兩個或更多個相鄰切口。
[0039] 根據改變DNA祀核酸的方法,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的相同鏈上。根據 一個方面,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的相同鏈上并導致同源重組。根據一個方面, 兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上。根據一個方面,兩個或更多個相鄰切口在雙 鏈DNA的不同鏈上并創建(形成,create)雙鏈斷裂。根據一個方面,兩個或更多個相鄰切口 在雙鏈DNA的不同鏈上并創建雙鏈斷裂,得到非同源性末端接合(nonhomologons end joining)。根據一個方面,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并相對彼此偏移。 根據一個方面,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并相對彼此偏移W及創建雙 鏈斷裂。根據一個方面,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并相對彼此偏移W及 創建雙鏈斷裂,得到非同源性末端接合。根據一個方面,方法進一步包括將編碼供體核酸序 列的第=外來核酸引入至細胞中,其中,兩個或更多個切口導致祀核酸與供體核酸序列的 同源重組。
[0040]根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,包括將編碼兩種或更多種 RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸的相鄰位點,將編碼至少一種 RNA向導的DNA結合蛋白切口酶并由兩種或更多種RNA向導的第二外來核酸引入至細胞中, 并且其中,兩種或更多種RNA和至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶表達,并且其中,至 少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切割DNA祀 核酸,得到兩個或更多個相鄰切口,并且其中,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈 上并創建雙鏈斷裂,導致祀核酸片段化(fragmen化tion),從而防止祀核酸表達。
[0041 ]根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,包括將編碼兩種或更多種 RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸的相鄰位點,將編碼II型 CRISPR系統的至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶并由兩種或更多種RNA向導的第二外 來核酸引入至細胞中,并且其中,兩種或更多種RNA和II型CRISPR系統的至少一種RNA向導 DNA結合蛋白切口酶表達,并且其中,II型CRISPR系統的至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切 口酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切害化NA祀核酸,得到兩個或更多個相鄰切 口,并且其中,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并創建雙鏈斷裂,導致祀核酸 片段化,從而防止祀核酸表達。
[0042] 根據一個方面,提供了改變細胞中的DNA祀核酸的方法,包括將編碼兩種或更多種 RNA的第一外來核酸引入至細胞中,每種RNA互補于DNA祀核酸的相鄰位點,將編碼具有一個 非活性核酸酶結構域并由兩種或更多種RNA向導的至少一種化s9蛋白切口酶的第二外來核 酸引入至細胞中,并且其中,兩種或更多種RNA和至少一種化s9蛋白切口酶表達,并且其中, 至少一種化s9蛋白切口酶與兩種或更多種RNA共定位至DNA祀核酸并切割DNA祀核酸,得到 兩個或更多個相鄰切口,并且其中,兩個或更多個相鄰切口在雙鏈DNA的不同鏈上并創建雙 鏈斷裂,導致祀核酸片段化,從而防止祀核酸表達。
[0043] 根據一個方面,提供了包含W下的細胞:編碼兩種或更多種RNA的第一外來核酸, 每種RNA互補于DNA祀核酸的相鄰位點,和編碼至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶的第 二外來核酸,并且其中,兩種或更多種RNA和至少一種RNA向導的DNA結合蛋白切口酶是用于 DNA祀核酸的共定位復合物的成員。
[0044] 根據一個方面,RNA向導的DAN結合蛋白切口酶是II型CRISPR系統的RNA向導的DNA 結合蛋白切口酶。根據一個方面,RNA向導的DNA結合蛋白切口酶是具有一個非活性核酸酶 結構域的化s9蛋白切口酶。
[0045] 根據一個方面,細胞是真核細胞。根據一個方面,細胞是酵母細胞、植物細胞或動 物細胞。根據一個方面,細胞是哺乳動物細胞。
[0046] 根據一個方面,RNA包含約10至約500個之間的核巧酸。根據一個方面,RNA包含約 20至約100個之間的核巧酸。
[0047] 根據一個方面,祀核酸與疾病或有害狀況相關。
[0048] 根據一個方面,兩種或更多種RNA是向導RNA。根據一個方面,兩種或更多種RNA是 tracrRNA-crRNA 融合體。
[0049] 根據一個方面,DNA祀核酸是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA或外源DNA。
[0050] 根據一個方面,方法可W包括同時使用正交RNA向導的DNA結合蛋白切口酶、正交 RNA向導的DNA結合蛋白核酸酶、正交RNA向導的核酸酶無效DNA結合蛋白。因此,在相同細胞 (同一細胞)中,可W進行通過切割(切口,nicking)或剪切kutting)DNA創建的改變和翻譯 介導(translational med