用于特應性皮炎的組合治療的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及醫藥領域，具體地設及治療皮炎或者濕疹的領域，甚至更具體地設及 治療特應性皮炎(atopiC dermatitiS)的領域。本發明設及新型組合物和新型的多部分試 劑盒化it Of parts),兩者包含抗炎化合物和特異祀向細菌細胞，優選地革蘭氏陽性細菌 細胞的化合物。本發明進一步地設及所述組合物和/或多部分試劑盒用于醫藥應用，優選地 用于治療遭受濕疹的個體。
【背景技術】
[0002] 濕疹是W發紅、發癢的皮膚W及小的瘤疹為特征的常見皮膚狀況，在本領域中還 被稱為皮疹或瘤疹或皮炎。對于濕疹沒法治愈，但是有許多治療，范圍從特定的飲食到潤膚 劑和抑制免疫力的軟膏，像例如皮質類固醇軟膏。雖然皮質類固醇，如氨化可的松或丙酸氯 氣美松(局部的、口服的或皮內的給藥)通常產生改善的效果，但它們還可能具有副作用。長 期使用局部的皮質類固醇被認為具有增強副作用的風險，最常見的副作用是皮膚變得薄且 易受傷的（萎縮）。鑒于此，如果在臉上或其他脆弱的皮膚上使用，那么應該經常使用低強度 的類固醇或不那么頻繁施用。另外，大面積或者在閉塞下使用高強度的類固醇，可能使其吸 收至體內，引起下丘腦-垂體-腎上腺軸抑制化PA軸抑制）。
[0003] 由于在特應性皮炎中受損的皮膚屏障，可能導致具有如金黃色葡萄球菌的細菌或 者真菌的皮膚感染的增強。為了防止更嚴重的情形，皮膚科醫生也會開局部的或者口服的 常規抗生素如青霉素、鏈霉素和氯霉素。抗生素防止可能由受損的皮膚屏障如破損的皮膚 所引起的感染。金黃色葡萄球菌定殖レolonization)或感染是增強濕疹嚴重性的最常見原 因。抗生素治療的有效性因人而異。常規抗生素眾所周知的缺點是非特異性（a-specif icity)，即還將非致病的和/或有利的細菌殺傷，W及不僅通過祀向細菌細胞還可能 通過其他病原菌而發展耐藥性的風險。此外，常規的全身抗生素治療可W能與其它藥物(包 含避孕藥)相互作用。某些抗生素不能與酒精組合使用。因此，還需要改善濕疹的治療。
【發明內容】
[0004] 在第一方面中，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的新型組合物，其中 所述第一化合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異地祀向細菌細胞、優選地革蘭氏 陽性細菌細胞的化合物。優選地，所述革蘭氏陽性細菌細胞是葡萄球菌，更優選地金黃色葡 萄球菌。優選地，所述組合物是優選地用于濕疹治療的藥物，最優選用于特應性皮炎的治療 的藥物，如在本文中更多地詳述。治療濕疹的現有技術的水平是使用免疫抑制劑(像皮質類 固醇）W及如果需要局部用藥或全身用藥的（systemic)抗生素。本發明提供了包含抗炎化 合物W及特異地祀向細菌細胞，優選地革蘭氏陽性細菌細胞，優選地金黃色葡萄球菌的化 合物的新型組合物，其克服了大部分（即使不是所有的）單獨或組合使用皮質類固醇和/或 常規抗生素的有效給藥方案的缺點，并且提供了出乎意料的協同作用。與單獨使用免疫抑 制劑如同單獨使用皮質類固醇相比，通過抗擊由細菌細胞(如革蘭氏陽性細菌細胞，優選地 金黃色葡萄球菌）引起的濕疹相關的和/或皮質類固醇引起的感染，本發明的組合物降低了 風險和/或是更加有效的。此外，與單獨使用皮質類固醇相比，根據本發明的組合物可W與 單獨使用皮質類固醇同樣有效，同時使得使用更低的劑量和/或更短的給藥方案產生皮質 類固醇更短的曝露時間從而減小可能的副作用（side-effect),如同皮膚萎縮、下丘腦-垂 體-腎上腺軸抑制(HPA軸抑制)和/或(增強的)皮膚感染的風險。
[0005] 與將皮質類固醇結合常規抗生素使用和/或單獨使用常規抗生素相比，本發明的 組合物選擇特異地祀向細菌細胞，優選地革蘭氏陽性細菌細胞，優選地葡萄球菌，更優選地 金黃色葡萄球菌，而沒有影響周圍的共生的和/或有利的微生物群落(microflora)。此外， 由于使用更低的量的抗生素或甚至完全不使用抗生素，削弱了或者至少降低了發展針對抗 生素的抗性的風險。
[0006] 特異祀向革蘭氏陽性細菌細胞的試劑優選的是，相比于革蘭氏陰性細菌細胞對革 蘭氏陽性細菌細胞顯示出高出至少2、5、10、50或100倍的溶菌活性（lytic activity)的試 劑。優選地，特異祀向革蘭氏陽性細菌細胞的試劑是在對革蘭氏陽性細菌細胞溶菌有效的 濃度下而不影響革蘭氏陰性細菌細胞的試劑。特異祀向葡萄球菌細菌細胞的試劑優選的 是，相比于非葡萄球菌細菌細胞對葡萄球菌細菌細胞顯示出高出至少2、5、10、50或100倍的 溶菌活性的試劑。優選地，特異祀向葡萄球菌細菌細胞的試劑是在對葡萄球菌細菌細胞溶 菌有效的濃度下而不影響非葡萄球菌細菌細胞的試劑。特異祀向金黃色葡萄球菌細菌細胞 的試劑優選的是，相比于非金黃色葡萄球菌細菌細胞對金黃色葡萄球菌細菌細胞顯示出高 出至少2、5、10、50或100倍的溶菌活性的試劑。優選地，特異祀向金黃色葡萄球菌細菌細胞 的試劑是在對金黃色葡萄球菌細菌細胞溶菌有效的濃度下而不影響非金黃色葡萄球菌細 菌細胞的試劑。優選地，如在本文中舉例說明的評估溶菌活性。
[0007] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞，優選地革蘭氏陽性細菌細胞 的化合物，并且其中所述第二化合物包含至少一種特異結合所述細菌細胞、優選地革蘭氏 陽性細菌細胞的膚聚糖細胞壁的細胞壁結合結構域。將本發明的細胞壁結合結構域限定為 成分，優選地所述第二化合物內的多膚，其引導所述第二化合物至細菌細胞的細菌壁。
[0008] 在本發明內所包括的細胞壁結合結構域可W是本領域的技術人員所已知的任何 細胞壁結合結構域。優選地，本發明的細胞壁結合結構域是成分，優選地所述第二化合物內 的多膚，其引導第二化合物至革蘭氏陽性細菌細胞的膚聚糖細胞壁，優選地葡萄球菌細菌 細胞的膚聚糖細胞壁，更優選地金黃色葡萄球菌細菌細胞的膚聚糖細胞壁。
[0009] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞，優選革蘭氏陽性細菌細胞的 化合物，并且其中所述第二化合物包含至少一種特異地結合葡萄球菌，更優選地，金黃色葡 萄球菌，的膚聚糖細胞壁的細胞壁結合結構域。
[0010] 可W使用本領域技術人員眾所周知的測定法(assay)來評估結構域與葡萄球菌屬 的膚聚糖細胞壁的結合。在一種優選的實施方式中，使用免疫組化技術和/或產生標記的構 建體的基因融合技術，用于評估如膚、多膚、蛋白質的化合物或隧菌體(bac t er i ophage S)與 葡萄球菌屬的膚聚糖細胞壁的特異性結合。在上述免疫組化或融合技術中使用的信號的定 量方法為本領域技術人員所熟知。
[0011] 在一種實施方式中，使用包含感興趣的細胞壁結構域的巧光融合構建體來定量葡 萄球菌膚聚糖細胞壁結合。Loessner等人（Molecular Microbiology 2002,44(2): 335-349)詳細描述了運樣的細胞壁結合測定法。在運種測定法中，使包含所述巧光融合構建體 或陰性對照(優選地綠色巧光蛋白（GFP))的溶液經受葡萄球菌細胞(優選地金黃色葡萄球 菌細胞，更優選地金黃色葡萄球菌BB255)規定的時間段，之后，通過離屯、將細胞與結合的巧 光融合構建體一起沉淀。將暴露于巧光融合構建體的葡萄球菌細胞的巧光信號減去暴露于 陰性對照（優選地GFP)的葡萄球菌細胞的巧光信號即為本公開所指的細胞結合的量度 (measure)。優選地，在本發明的上下文中，當使用運種測定法檢測到沉淀的細胞的巧光信 號提高至如在本文中所限定的陰性對照之上時，則認為結構域結合葡萄球菌屬的膚聚糖細 胞壁。優選地，本發明設及細胞壁結合結構域，其表現出結合如本文中限定的至少50、60、 70、80、90或100、150或200%的金黃色葡萄球菌隧菌體0263&1內溶素（由沈Q ID N0:2限定 Ply2638內溶素），優選地由SEQ ID NO: 1編碼，的細胞壁結合的膚聚糖。優選地，在運種測定 法中由SEQ ID NO:95表示的W及由SEQ ID NO:96編碼的融合構建體可作為陽性對照。在表 2中給出了包含的所有序列的總覽W及它們的SEQ ID NO。
[0012] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞、優選地革蘭氏陽性細菌細胞 的化合物，并且其中所述第二化合物包含至少一種起源于葡萄球菌隧菌體內溶素或者是葡 萄球菌隧菌體內溶素的同系物的細胞壁結合結構域，優選地所述葡萄球菌隧菌體內溶素選 自，但不限于，金黃色葡萄球菌隧菌體0263&1內溶素、金黃色葡萄球菌隧菌體O 11內溶素、 金黃色葡萄球菌隧菌體O Twort內溶素、溶血葡萄球菌JCSC1435、金黃色葡萄球菌隧菌體K 內溶素、華納葡萄球菌隧菌體WMY內溶素、金黃色葡萄球菌隧菌體NM3內溶素和金黃色葡萄 球菌SOal地a內溶素。
[0013] 還優選源自模仿葡萄球菌溶葡球菌素（由SEQ ID N0:76表示，優選地由SEQ ID N0:75編碼)或模仿葡萄球菌溶葡球菌素的同系物的細胞壁結合結構域。一種已知的具有細 胞壁結合性的模仿葡萄球菌溶葡球菌素的同系物是頭狀葡萄球菌ALE-I酶。
[0014] 優選地，所述細胞壁結合結構域具有與SEQ ID N0:4、6或8中任一個至少80%的同 一性和/或其中所述一種或多種酶促活性結構域具有與SEQ ID NO: 10、12、14、16、18、98或 100中任一個至少80%的同一性。本發明優選的細胞壁結合結構域是具有與在本文中由SEQ ID N0:4限定的并且優選地由SEQ ID N0:3編碼的模仿葡萄球菌溶葡球菌素的細胞壁結合 結構域至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的細胞壁結合結構域。還優選分離自天然的葡萄球菌隧菌體內溶素的細胞壁結合結 構域。本發明還優選的細胞壁結合結構域是具有與在本文中由SEQ ID N0:6限定的并且優 選地由SEQ ID N0:5編碼的金黃色葡萄球菌隧菌體0263&1內溶素的細胞壁結合結構域至 少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或 100% 同一性的 細胞壁結合結構域。還優選的是分離自天然的金黃色葡萄球菌隧菌體地iNM3內溶素的細胞 壁結合結構域。優選地，本發明的細胞壁結合結構域是具有與在本文中由SEQ ID N0:8限定 的并且優選地由SEQ ID NO:7編碼的金黃色葡萄球菌隧菌體地i醒3內溶素的細胞壁結合結 構域至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% 同 一性的細胞壁結合結構域。
[0015] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞、優選革蘭氏陽性細菌細胞的 化合物，其中所述第二化合物包含一種或多種表現祀結合特異性的酶促活性結構域 (enzymatic active domains)。本文中限定的"酶促活性結構域"是具有溶菌活性、優選地 表現出膚聚糖水解酶活性的結構域。可W通過本領域的專業技術人員眾所周知的方法評估 溶菌活性。在一種實施方式中，通過測量基質細胞懸浮液濁度的下降，分光光度地 (spectro地Otometrical Iy)評估溶菌活性。通過測量在595nm波長下的光密度來評估濁度， 通常當在595nm波長下培養物表現出至少0.30D的光密度時，將該培養物稱為是混濁的。優 選地，通過測量金黃色葡萄球菌懸浮液濁度的下降，分光光度地 (spectrophotometrically)評估溶菌活性，其中通過分光光度地測量OD日9日來量化濁度 化化ra S22 ,Biochrom)。更優選地，將200nM的包含如在本文中確定的本發明的酶促活性結 構域的多膚與由分光光度地化化ra S22、Bioc虹om)評估的具有1±0.05的初始OD日9日的金黃 色葡萄球菌懸浮液一起在PBS緩沖液pH7.4、120mM氯化鋼中在37°C下溫育30min。通過由溫 育30min前的所述OD日9日中減去溫育30min后的OD日9日來計算濁度的下降。在本發明的上下文 內，據稱包含如如在本文中確定的本發明的酶促活性結構域的多膚將具有溶菌活性，如果 如此，當使用運種測定法時，那么檢測出至少10、20、30、40、50或60 %的濁度下降。優選地， 檢測到至少70%的濁度下降。優選地，包含本發明的酶促活性結構域的多膚表現出比金黃 色葡糖球菌隧菌體巫263貼內溶素（由SEQ ID NO: 2確定Ply2638內溶素，優選地由SEQ ID ^:1編碼)的溶菌活性的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150或200%或更高的溶菌活性。
[0016] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞、優選革蘭氏陽性細菌細胞的 化合物，其中所述第二化合物包括一種或多種表現出祀結合特異性的酶促活性結構域，并 且其中所述祀結合是在所述細菌細胞，優選地革蘭氏陽性細菌細胞，的膚聚糖層中的必不 可少的結合。在本文中，將細菌細胞、優選地革蘭氏陽性細菌細胞的膚聚糖層中的必不可少 的結合(鍵，bond)限定為所述膚聚糖內的連接，即該連接對于所述膚聚糖為所述細菌細胞 提供形狀和耐滲透壓沖擊的剛性結構是必不可少的。優選地，在革蘭氏陽性細菌細胞的膚 聚糖層中的所述必不可少的結合是干膚的D-丙氨酸與橫橋膚(cross-bridge peptide)的 甘氨酸之間的結合(在本文中還被限定為N-末端丙氨酸與甘氨酸之間的結合）、在五甘氨酸 橫橋中的結合(在本文中還被限定為五甘氨酸橋甘氨酷-甘氨酷結合）、N-乙酷胞壁酸與k 丙氨酸之間的結合或者N-乙酷基胞壁胺與N-乙酷氨基葡糖之間的結合或者N-乙酷氨基葡 糖與N-乙酷基胞壁胺之間的結合。其他優選的在革蘭氏陽性細菌細胞的膚聚糖層中必不可 少的結合是在丫-谷氨酷基干膚中的結合、在干膚（stem P邱*1(16)中心丙氨酷基-異-D-谷 氨酸之間的結合、W及在干膚中異-D-谷氨酸A-賴氨酸之間的結合。
[0017] 大多數表現出膚聚糖水解酶活性的天然的葡萄球菌隧菌體內溶素由C-末端細胞 壁結合結構域(CBD)、中央N-乙酷基胞壁酸基-心丙氨酸酷胺酶結構域、W及與半脫氨酸、組 氨酸依賴性酷胺水解酶/膚酶(CHAP)同源的N-末端丙氨酷-甘氨酷膚鏈內切酶結構域組成， 或者在Ply2638的情況下由與膚酶_M23同源的N-末端甘氨酷-甘氨酸膚鏈內切酶結構域組 成，后=種表現膚聚糖水解酶活性的結構域的每一種具有不同的祀結合特異性并且在本文 中通常命名為酶促活性結構域。優選地，所述一種或多種的酶促活性結構域選自或W下組 成的組的結構域的排列（permutation):半脫氨酸、組氨酸依賴的酷胺水解酶/膚酶 化istidine d邱endent amidohydrolases/p邱tidase)結構域、膚鏈內切酶結構域、酷胺酶 結構域和糖基水解酶(glycosy Ihydrolase)結構域。所述糖基水解酶結構域可W是胞壁質 酶(muramidase)結構域或氨基葡萄糖巧酶(glycosaminidase)結構域。
[001引優選地，所述CHAP結構域切割膚聚糖層內的N-末端丙氨酷和甘氨酷之間的結合。 更優選地，所述CHAP結構域特異性地切割膚聚糖層內的N-末端丙氨酷和甘氨酷之間的結 合。優選地，所述膚鏈內切酶結構域切割膚聚糖層內的五甘氨酸(pentaglycin)橋甘氨酷-甘氨酷結合。更優選地，所述膚鏈內切酶特異性地切割膚聚糖層內的五甘氨酸橋甘氨酷-甘 氨酷結合。優選地，所述酷胺酶結構域切割膚聚糖層內的中央N-乙酷基胞壁酷基 (acetlymuramoylWPk丙氨酸之間的結合。更優選地，所述酷胺酶結構域特異性地切割膚 聚糖層內的中央N-乙酷基胞壁酷基和^丙氨酸之間的結合。優選地，所述胞壁質酶 (murimidase)結構域切割膚聚糖層內的N-乙酷基胞壁胺(acetylmuramine)和N-乙酷葡糖 胺之間的結合。更優選地，所述胞壁質酶結構域特異性地切割膚聚糖層內的N-乙酷基胞壁 胺和N-乙酷葡糖胺之間的結合。優選地，所述氨基葡萄糖巧酶結構域切割膚聚糖層內的N-乙酷葡糖胺(acetlyglucosamine)和N-乙酷基胞壁胺之間的結合。優選地，所述氨基葡萄糖 巧酶（g 1 U C O S am i n i d a S e )結構域特異性地切割膚聚糖層內的N -乙酷葡糖胺 (acetlyglucosamine)和N-乙酷基胞壁胺之間的結合。優選地，所述膚聚糖層是細菌細胞、 優選地革蘭氏陽性細菌細胞、更優選地葡萄球菌、最優選地金黃色葡萄球菌的膚聚糖層。優 選地，如果利用如在本文中限定的酶促活性結構域對一種結合的水解比使用所述酶促活性 結構域對上文所限定的任何其他結合的水解至少2、5、10、50或100倍更加有效，那么由所述 酶促活性結構域對該種結合的切割是特異性的。
[0019] 優選地，包含在本發明內的CHAP結構域源自葡萄球菌隧菌體K、葡萄球菌隧菌體 Twort與/和金黃色葡萄球菌隧菌體曲i 11。優選地，包含于本發明內的CHAP結構域是與SEQ ID 側：10、12或98具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99或100%同一性的結構域和/或優選地由SEQ ID N0:9或11編碼。優選地，包含在本發 明內的膚鏈內切酶源自金黃色葡萄球菌隧菌體〇2638a與/和模仿葡萄球菌。優選地，包含 在本發明內的膚鏈內切酶結構域與SEQ ID N0:14或16具有至少80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性和/或優選地由沈910顯： 13或15編碼。優選地，包含在本發明內的酷胺酶源自金黃色葡萄球菌隧菌體?2638a或金黃 色葡萄球菌隧菌體地i 11。優選地，本發明的酷胺酶結構域與SEQ ID NO: 18或100具有至少 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性和/ 或優選地由SEQ ID NO: 17或99編碼。
[0020] 優選地，本發明提供了包含第一化合物和第二化合物的組合物，其中所述第一化 合物是抗炎化合物并且所述第二化合物是特異祀向細菌細胞、優選地革蘭氏陽性細菌細胞 的化合物，其中所述第二化合物是天然存在的或突變的隧菌體(bacteriophage)、天然存在 的內溶素或突變的多膚。
[0021] 本發明的天然存在的隧菌體可W是任何特異祀向并且感染細菌細胞、優