轉移抑制劑的制作方法
【專利說明】轉移抑制劑
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本專利要求申請日為2013年4月5日的美國臨時申請號61/808,966的優先權，其在 此通過提述W其整體并入。 發明領域
[0003] 本專利設及包含抗體、核酸分子、多核巧酸和膚的組合物和制劑，W及它們用于預 防和治療轉移性癌癥，特別是用于降低、阻遏、或抑制癌細胞增殖、轉移和/或血管生成的方 法。
[0004] 對電子提交文本的說明
[000引隨此一道電子提交的文本文件內容再次通過提述W其整體并入:序列表的計算機 可讀形式拷貝（文件名:BMRK_006_0 lW0_SubSeqLi St_ST25. txt，數據記錄于2014年4月4日， 文件大小:58千字節）。
[0006] 發明背景
[0007] MARCKS蛋白（肉豆違酷化的富丙氨酸C激酶底物)是蛋白激酶C(PKC)的普遍存在的 憐酸化祀標化i等，Journal Of Biological Chemistry 276;40982(2002))eMARCKS具有S 個進化保守區（Aderem等，化ture 1988; 332: 362-364; Ilielen等，化ture 1991; 351: 320-322;化rtwig等，化ture 1992;356:618-622;Seykora等J Biol ^eml996;271:18797-18802):N末端、憐酸化位點域(或PSD，也稱為效應器域）、和多同源性2(MH2)域。N末端是包 含24個氨基酸具有經酷胺鍵連接至N末端甘氨酸殘基的肉豆違酸部分的a-氨基酸序列，其 設及MARCKS對細胞中的膜的結合（S巧kora等J Biol化em 1996;271:18797-18802)并且 可能與巧調蛋白結合(Matsubara等J Biol Chem 2003;278:48898-48902)。此24個氨基酸 的序列稱為MANS膚。MANS膚和相關膚公開于美國專利號7，265，088; 7，529，926; 7，544，772; 8,492,518;8,501，911;7,918,293,870;和8,563,689中，各文件的全部內容通過提述^其 整體并入。
[0008] 本領域中需要新的安全的療法來預防、治療和抑制癌癥，包括抑制癌細胞轉移、癌 細胞增殖、腫瘤生長、和/或血管生成。本發明解決了運些和其他的需求。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明設及對于預防或治療癌癥有用的方法和組合物。在一個實施方案中，提供 了用于抑制癌細胞轉移、癌細胞增殖、腫瘤生長、或血管生成的方法和組合物。在一個實施 方案中，提供了用于抑制癌細胞轉移、癌細胞增殖、腫瘤生長、或血管生成的方法和組合物， 包括對肉豆違酷化的富丙氨酸C激酶底物(MARCKS)的抑制。在一個實施方案中，組合物包含 MARCKS-抑制性化合物，包括膚、多膚、抗體或其片段、W及核酸分子如反義多核巧酸、適配 體(aptamer)、小干擾RNA(SiRNA)、微小RNA(miRNA)、和短發夾RNA(ShRNA)。本申請所用的 "MARCKS-抑制性核酸分子"指的是降低MARCKS的表達和/或功能的多核巧酸或核酸分子如 siRNA、miRNA、shRNA、或反義多核巧酸。在一個實施方案中，所述組合物包含一個或多個 MARCKS相關的膚。在另一個實施方案中，所述MARCKS相關的膚對應于MARCKS的MH2域。在另 一個實施方案中，所述膚是肉豆違酷化的N末端序列(MANS膚，其是MARCKS的24個氨基酸的 片段)相關的膚（即"MANS相關的膚"）。在又一個實施方案中，MANS相關的膚選自下組:MANS 膚;未取代的MANS片段，其含有四個或更多氨基酸且包含與MANS膚中N末端氨基酸序列中所 發現的相同的序列；包含與MANS膚或MANS膚片段中所發現的序列基本上相同的序列的膚； MANS膚或MANS膚的片段，其具有與MANS膚完全相同或基本上相同的氨基酸序列，其進行了N 末端肉豆違酷化或例如W乙酷基進行了 N末端乙酷化;和MANS膚或MANS膚的片段，其具有與 MANS膚完全相同或基本上相同的氨基酸序列，其C末端經化學修飾。在一個實施方案中， MANS相關的膚是N末端和C末端都被化學修飾的。在一個實施方案中，本申請提供的MARCKS-抑制性化合物是抗體或其片段。在一個實施方案中，所述抗體或其片段抑制MARCKS蛋白的 功能。在另一個實施方案中，所述抗體或其片段結合至MARCKS蛋白的N末端或MARCKS蛋白的 MH2序列。我們令人驚訝地發現，使用不同類型的MARCKS-抑制性化合物顯示出對癌細胞體 外遷移的抑制效果，并抑制體內轉移。在一個實施方案中，MARCKS-抑制性化合物展示出對 侵襲性癌細胞系的遷移的抑制效果。在一個實施方案中，本申請提供的MARCKS-抑制化合物 抑制哺乳動物的腫瘤中癌細胞的轉移。在又一個實施方案中，所述腫瘤是實體瘤。在另一個 實施方案中，所述腫瘤是非實體瘤。在一個實施方案中，本申請提供的MARCKS-抑制化合物 抑制與淋己瘤或白血病相關的癌細胞的轉移。
[OOU] 在一個實施方案中，MARCKS-抑制性化合物包括MARCKS-抑制性多核巧酸或 MARCKS-抑制性核酸分子。在進一步的實施方案中，所述MARCKS-抑制性化合物是抑制 MARCKS表達和/或功能的反義1?酷、311?酷、3111?酷、或微小1?酷多核巧酸。在一個實施方案中， MARCKS-抑制性化合物是調節MARCKS表達的蛋白或多核巧酸的模擬物，例如miR21的模擬 物。
[0012] 在一個實施方案中，MRCKS-抑制性化合物是MRCKS相關的或MANS相關的膚。在另 一個實施方案中，MARCKS相關的膚對應于MARCKS的N末端肉豆違酷化的域。因此，在一個實 施方案中，MARCKS相關的膚是MANS相關的膚。在一個實施方案中，MANS相關的膚和一些經化 學修飾的MANS相關的膚阻遏侵襲性癌細胞系的遷移。在一個實施方案中，MANS相關的膚用 于對癌細胞的轉移發揮抑制性效果。在一個實施方案中，MRCKS-抑制性化合物展現出對癌 細胞體內轉移的阻遏效果。抑制轉移性疾病的體內位點包括至少肺組織、屯、臟組織、脾組 織、腸組織、和隔膜組織。在一個實施方案中，MANS相關的膚用于治療或預防癌細胞轉移、癌 細胞增殖、腫瘤細胞生長、或血管生成。
[0013] 在一個方面，提供了用于治療或預防癌癥的組合物和方法，包括將MARCKS-抑制性 化合物施用于癌細胞或在癌細胞的發育、維持、增殖或轉移中起作用的細胞。在一個實施方 案中，提供了用于抑制癌細胞轉移的方法，包括對癌細胞施用轉移抑制量的MARCKS-抑制性 化合物。在一個實施方案中，提供了用于抑制癌細胞轉移的方法，包括對癌細胞施用轉移抑 制量的MANS相關的膚。在另一個實施方案中，提供了用于在腫瘤中抑制癌細胞轉移的方法， 包括對癌細胞施用轉移抑制量的膚，所述膚具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:1至 沈Q ID NO:231(含）、沈Q ID NO:234、和沈Q ID NO:235;其中所述膚序列的N末端和/或C末 端氨基酸任選地經化學修飾。在另一個實施方案中，提供了用于在對其有需要的受試者中 治療癌癥的方法，所述方法包括對所述受試者施用治療有效量的MANS相關的膚。在另一個 實施方案中，提供了用于在對其有需要的受試者中治療癌癥的方法，所述方法包括對所述 受試者施用治療有效量的膚，所述膚具有選自下組的氨基酸序列：SEQ ID N0:1至SEQ ID NO :231(含）、SEQ ID NO :234、和SEQ ID NO :235;其中所述膚序列的N末端和/或C末端氨基 酸任選地經化學修飾。
[0014] 在一個實施方案中，所述膚的N末端氨基酸通過膚的N末端氨基酸酷化而被化學修 飾，所述酷化呈選自下組的酷胺的形式：
[0015] -C2(乙酷基)至C24脂肪族簇酸的酷胺，所述脂肪族簇酸可W是線性的、分枝的、飽 和的、或不飽和的，
[0016] -S氣乙酸的酷胺，
[0017] ?苯甲酸的酷胺，和
[0018] ? Cl至C24脂肪族烷基橫酸的酷胺;或者
[0019] ?所述膚的N末端氨基酸的N末端胺基可用選自下組的基團烷基化：
[0020] ? Cl至C24脂肪族烷基基團，
[0021 ].線性2-(打至C24脂肪族烷基)氧乙基基團，
[002引 ? CO-甲氧基-聚化締氧基)n-乙基基團，其中n為0至10。
[0023] 在進一步的實施方案中，所述N末端酷胺選自乙酷基和肉豆違酷基。
[0024] 在另一個實施方案中，所述膚的C末端氨基酸是經化學修飾的，所述化學修飾通過 在膚的C末端氨基酸的C末端簇酸基團處形成酷胺而進行，所述酷胺呈選自下組的酷胺形 式：
[00巧]?氨的酷胺，
[0026] ? Cl至C24脂肪族烷基胺的酷胺，
[0027] ?徑基取代的C2至C24脂肪族烷基胺的酷胺，
[002引 ?線性2-(打至C24脂肪族烷基)氧乙基胺基團的酷胺，和
[0029] ? CO-甲氧基-聚化締氧基)n-乙胺基團的酷胺，其中n為0至10。
[0030] 在一個實施方案中，分別提供了用于抑制癌細胞轉移的方法，或用于治療癌癥的 方法，包括對癌細胞或受試者施用MANS相關的膚。在一個實施方案中，所述膚選自下組:N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA ( SEQ ID N 0 : 1 ) ; N - 肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAパ沈QIDNo:2);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQID No:4);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID No:7);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID No:ll);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID No: 16) ;N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID No:22) ;N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAER (SEQ ID No:29);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID No:37);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID No:46);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID No:56);N-肉豆 違酷-GAQFSKTAAKGEA(沈Q ID No:67);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID No:79);N-肉豆 違酷-GAQFSKTAAKG(SEQIDNo:92);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(SEQIDNo:106);N-肉豆違 酷-GAQFSKTAA(SEQIDNo:121);N-肉豆違酷-GAQFSKTA(沈QIDNo:137);N-肉豆違酷-GAQFSKT(SEQIDNo:154);N-肉豆違酷-GAQFSK(SEQIDNo:172)，N-肉豆違酷-GAQFS(沈Q IDNo:191)，N-肉豆違酷-GAQF(SEQIDNo:211)，N-乙酷-RGAQFSKTAAK(SEQIDNo:2：M)， N-乙酷-RGAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:2：M)，N-乙酷-RAKGE(沈Q ID N0:235)，及其組合。 [0031 ] 在一個實施方案中，所述膚選自下組:N-乙酷-GAQFSKTAAK(SEQ ID No:106;BI0- 11006);N-肉豆違酷-AKGE(沈Q ID No:219;BI0-91200);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:106;BI0-11002);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(沈Q ID No:106;BI0-11000);N-乙酷-GAQFSKTAA(SEQIDNo:121;BI0-10901);N-肉豆違酷-GAQFSKTAAK(SEQIDNo:121;BI0-10900);和N-乙酷-GAQFSKTAAK-N肥（沈Q ID No:106)。在一個實施方案中，一些氨基酸Wd-構象存在。例如，在一個實施方案中，所述膚是N-乙酷-GAQFS(c〇KTAA(c〇K(SEQ ID N0:106; BIO-11037)，其中在所述膚的位置6和10處的賴氨酸化)是d-構象的。
[0032] 在一些實施方案中，MANS相關的膚展示出能使其適于在治療應用中，例如在癌癥 的治療中使用的特性。例如，在一個實施方案中，本申請公開的一些MANS相關的膚展示出相 對于(除MANS相關的膚W外的）一種或多種MANS膚增強的溶解性。在另一個實施方案中，本 申請提供的一些MANS相關的膚在血漿中展現出比（除MANS相關的膚W外的）一種或多種 MANS膚更長的半衰期。
[0033] 在一個實施方案中，MARCKS相關的膚展現出降低的癌細胞遷移。例如，在一個實施 方案中，用mans相關的膚（例如BI0-11006、BI011002、BI010901、BI010900、BI011000、或 BI0-91200)預處理癌細胞，在W約IOwii膚至約200WI1膚預處理細胞;或W約20皿至約200皿 預處理細胞;或W約25WI1膚至約75WI1膚預處理細胞時，降低癌細胞的遷移。在一個實施方案 中，當W約化M至約500yM、約扣M至約250測、或約IOiiM至約200測的濃度施用時，所述MARCKS 相關的膚展示出降低的癌細胞遷移。在一個實施方案中，當W約化M、約扣M、約lOiiM、約25y M、約50yM、約1 OOiiM、約150yM、約200yM、或約SOOiiM的濃度施用時，所述MARCKS相關的膚展示 出降低的癌細胞遷移。在一個實施方案中，在體外用所述膚處理癌細胞W確定膚的效果。在 一個實施方案中，癌細胞來源于患者。在進一步的實施方案中，在體外用所述膚處理癌細胞 W確定患者是否很可能響應于膚的治療。
[0034]在一個實施方案中，當W約O.Olmg/kg/天至約lOmg/kg/天的濃度施用于患者時， MRCKS相關的膚展現出降低的癌細胞轉移。在進一步的實施方案中，當W約O.lmg/kg/天至 約5.Omg/kg/天的濃度施用于患者時，MARCKS相關的膚展現出降低的癌細胞轉移。在更進一 步的實施方案中，當W約0.5mg/kg/天至約2.5mg/kg/天的濃度施用于患者時，MARCKS相關 的膚展現出降低的癌細胞轉移。例如，當W約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約0.75、約1.0、約 1.25、約1.5、約1.75、約 2.0、約 2.25、約 2.5、約 2.75、約 3.0、約 3.5、約 4.0、約 5.0、約