一種聚乙二醇修飾的巴西芬凈及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及藥物化學領域，具體設及聚乙二醇修飾的己西芬凈及其制備方法。 技術背景
[0002] 隨著大量抗菌藥物、抗腫瘤藥物、皮質激素和免疫抑制劑的使用增多W及器官移 植、介入技術手術和獲得性免疫缺陷綜合征發病率的逐年上升，深部真菌感染的發病率也 逐年增加。目前只有一些挫類抗真菌藥物(兩性霉素B，氣胞喀晚和一些挫類藥物)在運類治 療中起到效果。而此類藥物，從療效、藥物毒性，抗菌譜W及藥物抗性的角度看來，治療效果 有一定的局限性。其中大環內脂類抗菌素，兩性霉素B在臨床中運用的效果最好，與其他抗 菌藥物不同，兩性霉素B是同時作用于成熟的和正在生長的病原菌細胞。然而兩性霉素B的 靜脈給藥具有較大的毒性。因此，我們需要一種更安全、療效更好的抗菌素。
[0003] 己西芬凈是從絲狀真菌(Aureobasidiumpullulans)Rioe中分離出來的環醋膚類 抗生素，具有很強的抗真菌能力。在較低的濃度下(0.1-0.5μg/ml)即可對酵母產生毒性。對 其敏感的真菌種類包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevi Siae )、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、構巢曲霉 (Aspe;rgiIlusnidulans)和黑曲霉(A.niger.)。其作用機制是，己西芬凈抑制了真菌生長所 依賴的肌醇憐酷胺（inositol phospkxryIceramide，IPC)合成酶的活性，干擾銷脂合成，從 而進一步殺死菌株。并且，己西芬凈不會破壞DNA，RNA和蛋白質的合成。
[0004] 聚乙二醇是一種具有高度親水性的聚合大分子，其無毒，抑中性，是具有較好生物 相容性的獨特理化性質的一類高分子聚合物。聚乙二醇具有極強的親水性，且沒有免疫原 性，它與藥物連接W后會改變藥物的性質，將聚合物自身的優良性質賦予藥物分子。此外。 聚乙二醇是迄今為止已知的大分子聚合物中細胞和蛋白吸收水平最低的分子，鑒于其具有 W上優良性質，聚乙二醇已被美國抑A批準作為體內注射藥用聚合物分子。
[0005] 聚乙二醇修飾的己西芬凈有較強的溶解能力，而由于聚乙二醇在己西芬凈周圍形 成的屏障，產生了大分子的空間位阻作用，從而減少了己西芬凈在體內的酶解，使其半衰 期延長，避免了己西芬凈在腎臟中很快代謝消除，提高其治療效果。
【發明內容】
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[0006] 本發明設及一種聚乙二醇修飾的己西芬凈及其制備方法，目的在于在提高己西芬 凈的穩定性、延長其半衰期、提高其治療效果。
[0007] 為達到上述發明目的，本發明采用的技術方案是:先將聚乙二醇的一端與二班巧 酷亞胺碳酸醋連接形成活潑醋，所述聚乙二醇修飾劑與己西芬凈通過醋鍵連接，得到聚乙 二醇修飾的己西芬凈化合物。
[000引具體的，將活化的mPEG通過共價鍵偶聯到己西芬凈上，形成通式為D-R的化合物， 其中D為己西芬凈，R為聚乙二醇修飾劑陽G-(C = O)-D
[0009] 其中所述聚乙二醇為分子量3W)a~SOKDa的直鏈聚乙二醇，優選為分子量為3W)a， 6kDa，9kDa，I OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa 更優選分子量為 9kDa。
[0010] mPEG要和己西芬凈結合，需要根據連接分子的特性選擇活化所需的功能基團，對 mPEG分子的一端進行活化，常見具有生物相容性的活化基團包括醋基、酷胺基、酷亞氨基、 氨基甲酸醋基、簇基、徑基、班巧酷亞氨基、環氧基、氧幾基咪挫基、硝基苯基、醒基、半脫氨 酸基、組氨酸基或伯胺等。優選班巧酷亞胺班巧酷醋（SS)、班巧酷亞胺碳酷醋（SC)、對硝基 苯碳酸和醒基(adehyde)等，更優選班巧酷亞胺班巧酷醋(SC)。
[ocm]另外，本發明還提供了該復合物的制備方法，其工藝如下：
【附圖說明】
[0013] 圖1為己西芬凈抗菌活性
[0014] 圖2為己西芬凈在小鼠內的藥代動力學
【具體實施方式】：
[0015] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳述，但是本領域技術人員將會理 解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。
[0016] 實施例1制備mPEG-C(=0)-己西芬凈 [0017] 1. ImPEG-SC樣品的制備（3)
[001引將不同分子量的聚乙二醇陽G分別溶于適量的二氯甲燒中，加入1.1當量的DSC(二 班巧酷亞胺碳酸醋），2當量的DIEA(二異丙基乙胺），加入0.2當量的DMAP(N，N-二甲基氨基 化晚），溫控60°C，反應化，濃縮，異丙酸析晶，分別得到不同分子量的PEG班巧酷亞胺活化產 物陽G-SC。
[0019] 1.2mPEG-C(=0)-己西芬凈樣品制備(5)
[0020] 本發明的聚乙二醇修飾的己西芬凈包括W下步驟:將憐酸緩沖液加入己西芬凈溶 液中，調節其pH至6.0-9.0，然后加入mPEG-SC在5~40°C進行反應，優選為25°C，反應時間為 2~6小時，優選為4小時。將反應混合液用色譜分離，流動相為含氯化鋼醋酸緩沖液，色譜分 離后，濃縮，凍干可得不同分子量的聚乙二醇修飾的己西芬凈;所述的己西芬凈溶液重量為 Img/mL的水溶液。本發明所述的聚乙二醇修飾己西芬凈可W制備抗真菌藥物。
[0021 ]實施例2體外抗菌實驗比較
[0022] 取未修飾的己西芬凈及不同分子量的mPEG修飾后的己西芬凈（3kDa、化化、9kDa、 1040曰、2040曰、3040曰、4040曰、5040曰），分別置于37°(30,2,4,6,8，12,24,48,7化定時取樣 0.1ml，測定各時間點對抗真菌活性的影響，結果W活性保留百分數表示。試驗結果見圖1。
[0023] 實施例3不同分子量mPEG修飾的己西芬凈在小鼠體內的藥代動力學研究
[0024] 雄性昆明中小鼠84只，按隨機分成組，每只小鼠快速尾靜脈注射給藥分子量不同 的己西芬凈lOOuL，分別為basi化ngin，mPEG-C( =0)-basi化ngin(3kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(6kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(9kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(lOkDa)， mPEG-C( =0)-basifungin(20kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(30kDa)，mPEG-C( =0)-6日31化叫111(401^)日），111?66-(：(=0)-6日31化叫111(501^)日）。給藥0,2,4,6,8，12,24,48,7化（9 個時間點），眼球取血O.lmL，離屯、取血清，應用放射免疫法測定血藥濃度，經時曲線見圖2。 其中未經修飾的basifungin在1化時，血藥濃度最高為0.74mgA^L，5kDamPEG-C(=0)-basi 化 ngin 在化時 ，血藥濃度最高為 0.89mgAiL，9kDam 陽 G-C(=0)-basi 化 ngin 在 1 化時血 藥濃度最高為〇.93mgAiL，20kDam陽G-C(=0)-basifungin在24h時血藥濃度最高為0.73mg/ yL。W上結果可W得出，經PEG修飾的己西芬凈能明顯的延緩藥物延緩時間，其中隨著PEG分 子量的增大，其藥物代謝時間越長。綜合代謝時間W及藥物效果，W9kDa的PEG-(C = O)-b 曰 sifungin 最佳。
[00巧]實施例4 mPEG-C( =0)-basifungin的修飾條件 [00%] 1 .pH值對聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0027] 用25毫摩爾/升的化抽Kk-K出K)4緩沖液調節反應體系，調節反應體系寬起始抑值 5.0~10.0及窄起始pH值6.0~9.0進行實驗，維持反應體系己西芬凈濃度為0.5毫克/毫升， 溫度25°C，搖床轉速20化/min，總體積0.5毫升。反應4小時后，各加20微升30 %冰醋酸終止 反應。結果表明，反應體系起始pH值低于6.0時，PEG修飾己西芬凈反應不發生，起始pH值8.0 ~9.0時，有利于陽G修飾己西芬凈，聚乙二醇修飾己西芬凈的濃度達到0.11~0.12毫克/毫 升，總修飾率為44-50%。結果表明，聚乙二醇修飾己西芬凈反應進行的最優選pH為8.3,此 時聚乙二醇己西芬凈濃度為0.112毫克/毫升，總修飾率為56.8%。因此，控制反應體系的起 始抑值8.3為宜。
[0028] 2.反應時間對聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0029] 控制起始pH8.3,其他反應條件不變，研究反應對聚乙二醇修飾己西芬凈的影響。 分別于反應1、2、3、4、化取樣測定聚乙二醇修飾己西芬凈的含量。隨著反應時間的延長，聚 乙二醇修飾己西芬凈含量逐漸增加；當反應達到4h時，聚乙二醇修飾的己西芬凈含量達到 最高為0.137毫克/毫升。因此聚乙二醇修飾己西芬凈的反應時間W4小時為最優選。
[0030] 3.憐酸緩沖液對聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0031] 控制起始P冊.3,反應時間為4小時，其他條件不變。研究憐酸緩沖液對聚乙二醇修 飾己西芬凈的影響。分別控制憐酸緩沖溶液濃度為5、10、15、20、25、30、40、50毫摩爾/升，測 定mPEG-C( =0)-basi化ngin的含量。隨著憐酸緩沖溶液的增加，mPEG-C( =0)-basifungin 的含量呈逐漸減低的趨勢，但緩沖溶液濃度不宜太低，WlO-30毫摩爾/升為宜，優選為25毫 摩爾/升。
[0032] 4.溫度對聚乙二醇修飾己西芬凈的影響
[0033] 在優化實驗條件下，選擇5°C、25°C和40°C進行聚乙二醇修飾己西芬凈溫度實驗， 反應中定時取樣。溫度顯著影響聚乙二醇修飾己西芬凈的速率，溫度越高，反應速率越快。5 °C下，3小時前，反應速率隨著時間的延長而增加，3h后緩慢增加;3小時和24小時mPEG-C(= 0)-basi化ngin的含量分別為0.157毫克/毫升和0.224毫克/毫升，修飾率分別為32.3%和 34%。25°(3和40°(3下，地時111?66-"=0)-6日31化叫111含量達到最大，隨后呈緩慢降低趨勢。 聚乙二醇己西芬凈含量最大值分別為0.227毫克/毫升和