一種新穎的納米人工紅細胞、人工血液及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明是關于一種新穎的納米人工紅細胞、人工血液及其制備方法，以應用于解決體內供氧問題。
【背景技術】
[0002]臨床輸血的應用已非常廣泛，但目前輸血仍存在諸多問題:1.血液可能攜帶病原體(肝炎病毒、HIV等)，一些疾病可能通過輸血傳播;2.血型不匹配導致凝集反應，可威脅被輸血人的生命;3.血液來源短缺;4.血液的儲存時間短(42天)。近來，納米技術使人工氧載體得到快速發展，引起人們廣泛關注。人工氧載體是具有載氧功能的納米/微米尺寸的顆粒，可大規模合成，并且不會導致交叉感染和凝集反應。目前臨床上已經有多種人工氧載體產品作為血液代用品得到應用，這些氧載體包括全氟碳化合物、聚血紅蛋白、交聯血紅蛋白、血紅蛋白脂質體等。
[0003]全氟碳化合物因其疏水性難與血漿混合，生物相容性較差，且存在嚴重副作用。聚血紅蛋白與交聯血紅蛋白，由于血紅蛋白分子沒有納米顆粒的保護，不易維持血紅蛋白在體內的功能穩定性，而且容易被機體清除。血紅蛋白脂質體在體內的結構穩定性較差，所包裹血紅蛋白易泄露。
[0004]“脂質體包封豬血紅蛋白的制備及評價”(梁培德)公開了關于一種脂質體包封豬血紅蛋白的技術，具體是采用卵磷脂包封豬血紅蛋白，對工藝條件進行了優化，包封率穩定在(41.87±0.46)%。
[0005]“基于脂質體包封血紅蛋白構建人工紅細胞的工藝研究及其評價”(謝家馨)、“人工紅細胞及微囊包被血紅蛋白的制備與鑒定”(樊晶，王學謙，《中國輸血雜志》2004年02期)公開了一種脂質體包封血紅蛋白的技術，其中，首先通過低滲法制備高純度、高濃度的膜蛋白，然后根據界面縮聚法的原理，利用勻速微囊制備噴頭，將含有2，3-DPG、膜蛋白和血紅蛋白水相直接滴入到含磷脂的植物油中，通過高速攪拌使囊心物(2，3-DPG與血紅蛋白單體、二聚體構建的不穩定的四聚體)的周圍形成單個球狀膜殼型微囊。其中，謝家馨報道的人工紅細胞的包埋率為53%，樊晶等人報道的人工紅細胞的包埋率為27.7%。
[000?]基于目如的現有技術狀況，仍有待進一步提尚人工紅細胞的包封率，提尚人工血液的穩定性。
【發明內容】
[0007]本發明的一個目的在于提供一種新穎的結構穩定的納米人工紅細胞。
[0008]本發明的另一目的在于提供所述納米人工紅細胞的制備方法，提高人工紅細胞的包封率和穩定性。
[0009]本發明的另一目的在于提供一種含有所述納米人工紅細胞的人工血液。
[0010]—方面，本發明提供了一種納米人工紅細胞，該納米人工紅細胞采用血紅蛋白作為載氧分子，血紅蛋白被聚合物包載形成核心；核心外采用用聚乙二醇分子修飾的磷脂分子層模擬細胞膜保護血紅蛋白分子;并且，該納米人工紅細胞的尺寸為50-200nm。
[0011]根據本發明的具體實施方案，本發明的納米人工紅細胞中，所述血紅蛋白為動物血紅蛋白分子，例如牛血紅蛋白分子或豬血紅蛋白分子。血紅蛋白采用動物血液提取的血紅蛋白，能以高親和力結合氧氣分子，在體內可逆地將氧氣釋放，能替代血液輸送氧氣的功能。本發明采用聚合物分子包載動物血紅蛋白分子作為核心;核心外為磷脂分子層，并以聚乙二醇分子修飾以獲得良好生物相容性和長循環效果。
[0012]另一方面，本發明還提供了一種納米人工紅細胞的制備方法，該方法包括:
[0013]卵磷脂、DSPE-PEG、血紅蛋白加入乙醇水溶液中；其中，卵磷脂、DSPE-PEG、血紅蛋白的質量比為300?350: 200?300: 1500?2000 ；優選地，其中，卵磷脂在乙醇水溶液中的濃度為80?150yg/mL，更優選為100?120yg/mL;所述乙醇水溶液為濃度3?5 %的乙醇水溶液；
[0014]將濃度I?3mg/mL的PLGA的乙腈溶液逐滴加入到上述含有卵磷脂、DSPE-PEG、血紅蛋白的乙醇水溶液中，采用超聲波細胞破碎儀以1?30kHz的頻率及15?70W的功率超聲5?1min，制得棕紅色溶液；
[0015]超濾，并進行脫氧處理，得到所述納米人工紅細胞。
[0016]根據本發明的具體實施方案，本發明的納米人工紅細胞的制備方法中，超聲處理時，同時監控制備時的液體溫度，利用冰浴將溫度控制在40攝氏度以下，防止血紅蛋白受熱變性。
[0017]根據本發明的具體實施方案，本發明的納米人工紅細胞的制備方法中，所述超濾采用10kDa的超濾管進行，離心超濾兩次。其中，優選的離心條件為5000?7500r/min，每次離心5?1min0
[0018]根據本發明的具體實施方案，本發明的納米人工紅細胞的制備方法中，脫氧處理是通過將氮氣通入人工血液(放置于有導氣系統的密閉環境中)進行脫氧處理。
[0019]本發明的納米人工紅細胞在脫氧狀態下可儲存兩年以上，在充入氧氣后，可替代血液載氧功能。
[0020]另一方面，本發明還提供了一種人工血液，其中包括本發明所述的納米人工紅細胞。優選地，所述納米人工紅細胞的濃度為0.15?0.25mmol/L。
[0021]此外，所述人工血液還包括Na2HP04、KH2P04、NaCl和超純水等血液中的常規組分。這些常規組分的用量可參照現有技術進行。
[0022]例如，在本發明的一具體實施方案中，本發明的人工血液包括以下組分:
[0023]納米人工紅細胞(血紅蛋白濃度0.2mmol/L)、Na2HP04( 10mmol/L)、KH2P04(2mmol/L)、NaCl(137mmol/L)和KCl(2.7mmol/L)、超純水余量。本發明的人工血液可以是將所述組分充分混合后配制得到。
[0024]本發明的有益技術效果:
[0025]本發明中采用動物血紅蛋白作為載氧分子，不會引起交叉感染和凝集反應;可大規模合成，結構穩定，儲存時間可達兩年以上。血紅蛋白分子得到納米人工紅細胞的保護，包封率高，不易泄露，功能穩定性好。且該納米人工紅細胞在缺氧環境中能穩定釋放所載的氧氣，在體內具有良好的生物相容性、結構穩定性和功能穩定性，高效地為機體輸送氧氣，且不會導致明顯的副作用。本發明的制備方法簡便易行，便于操作推廣。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明的人工血液中納米人工紅細胞的透射電子顯微鏡照片。
[0027]圖2為相比于通氧純凈水和通氧游離血紅蛋白，納米人工紅細胞在缺氧環境的溶解氧濃度曲線。
[0028]圖3顯示本發明的人工血液的酸穩定性測試結果。
[0029]圖4顯示本發明的人工血液的熱穩定性測試結果。
【具體實施方式】
[0030]為了更清楚地理解本發明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發明。實施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照儀器制造商所建議的條件。
[0031]實施例1:納米人工紅細胞的制備
[0032]PLGA溶于乙腈中，濃度為2mg/mL ； 300yg卵磷脂、20