提供組織修復的含微顆粒的具有協同作用的真皮基質及其生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于治療慢性創傷的真皮基質及其生產方法，所述真皮基質能夠實現真皮組織的快速修復，并且在其結構中包括具備協同作用的含抗氧化劑的微顆粒。
【背景技術】
[0002]在當今的慢性創傷治療中，使用了諸如乳劑、凝膠、洗液和軟膏等常規產品。為了使所述產品在治療中有效，它們需要頻繁施用。此外，施用劑量也必須被標準化。
[0003]然而現有治療可以消除這些問題，其是常規方法的一部分。在這樣的治療應用中，使用異種移植和移植物轉移(graft transfer)方法，以便在大規模組織損失的區域上更換新組織。這些方法均是疼痛的，且同時可能具有基于供體的缺點。
[0004]慢性創傷治療中已知的最新的最終階段包括創新制劑。與現有技術方法相比，微顆粒系統和基質系統提供了有利的治療方法。作為進行文獻研究的結果，觀察到已開發出了包含協助區域愈合的試劑的基質，其提供了必要的機械支持，從而通過閉塞效應對因各種損傷而損失的組織區域進行補償。已制備了真皮基質，其特別地包括膠原蛋白-殼聚糖、膠原蛋白-明膠，膠原蛋白-糖胺聚糖以及膠原蛋白-透明質酸組合物，并通過向它們孵育成纖維細胞來制備，并且已觀察到了創傷組織的愈合。
[0005]真皮基質是為了有效支持細胞生長和發育而用天然或合成的聚合物制備的系統，并且這些真皮基質在創傷治療中的使用開辟了一個新的視野。這些結構的主要目的是使受損的組織重建，并將不同的生物材料和生物活性分子運載到該區域。
[0006]現今存在具有不同特點的使上皮愈合的商購產品。在所述產品中，使用了用殼聚糖(其是天然聚合物)制備的創傷貼片，或者使用諸如合成聚氨酯和PLGA等聚合物，并且提供了其中角質形成細胞在上皮中形成小集落的介質，從而獲得了更快的上皮形成。在替換上皮的所述產品中，提供了二維結構。然而，此種在上皮形成中優選的維度在需要三維結構的替代治療中是不足的。
[0007]創傷區域易患感染和類似的并發癥，并且防止感染的最有效方法是盡快提供有效治療。受傷后的頭六小時對細菌拓殖而言是更重要的時間段。防止感染的最有效方法是通過以下方式封閉創傷:在創傷上使用無菌貼片，并且在用無菌貼片封閉創傷前在無菌條件下清理創傷，這些條件甚至比抗生素治療更有效。出于此原因，立即覆蓋創傷、增加真皮層的自我修復并且發育出完全分層的組織(其會替換組織區域)是當前研究中需要解決的一些重要課題。
[0008]用于治療創傷的常規方法(軟膏、乳劑、凝膠、洗液)不能克服一些基本問題，例如創傷感染，脫水，熱損失，活組織仍未受保護，蛋白質、紅細胞、白細胞、免疫因子和微量元素的損失。
[0009]常規制劑的最重要的缺點之一是施用的量可能變化或改變，因此施用的劑量不能被標準化，并且需要頻繁進行施用。每次進行施用時，病人都會感覺疼痛，這使得治療過程更加困難。此外，由于表面活性劑或者這些制劑中所用的諸如防腐劑和香料等成分，也會出現過敏反應。除了常規療法，作為在大規模組織損失的情況下進行的另一種療法，移植物轉移也具有許多缺點。這些缺點可以是由供體傳播的疾病，或者是在取走移植物的供體區域形成新創傷。盡管自體移植為優選的材料，但在某些情況下在患者中可能不會有任何適合的可轉移組織。除此之外，在取走移植組織的區域會出現新的創傷。另一個缺點是這些過程可能需要外科手術。為了防止諸如感染等并發癥并克服所述缺點，認為創新方法對于縮短治療時間是必要的。
[0010]為了達到這些目的而制備的具有膠原蛋白、殼聚糖和明膠的制劑是二維系統，并且所述二維系統不足以提供物理支持。為了解決此問題，用于確保用膠原蛋白制備的真皮基質是包含化學材料的三維系統的方法會破壞細胞生長所需的條件。在現有技術中，為達到所述目的而開發的產品不包含微顆粒，并且其作用類似于使細胞可略微更快生長的創傷貼片。
【發明內容】
[0011]本發明的目的是提供一種真皮基質，其提高慢性創傷治療的效率、縮短愈合時間并確保組織修復。
[0012]本發明的另一目的是提供一種真皮基質，其不僅包含膠原蛋白和層粘連蛋白，而且還包含攜帶抗氧化劑的微顆粒，所述抗氧化劑有助于通過展現協同作用而加快組織修復速度。
[0013]本發明的另一目的是獲得一種能夠實現組織修復的真皮基質生產方法，其中使用由位于真皮天然結構內的蛋白質形成的試劑及其它組分。
[0014]本發明的另一目的是提供一種真皮基質生產方法，其通過采用并非化學方法的交聯方法而支持細胞生長和組織修復。
[0015]本發明的另一目的是提供一種真皮基質生產方法，其能夠實現組織修復，并且通過實施凍干工序而防止熱敏性生物材料降解。
【具體實施方式】
[0016]附圖中示出了為了達到本發明的目的而產生的真皮基質生產方法，其提供組織修復，其中所述附圖圖示了以下內容；
[0017]表1是本發明的方法的流程圖。
[0018]具有協同作用并提供組織修復的真皮基質生產方法(10)，其特征在于，其包括以下步驟:
[0019]制備真皮基質系統(11)，
[0020]制備膠原蛋白溶液系統(111)，
[0021 ]將層粘連蛋白添加到膠原蛋白溶液上并混合(112)，
[0022]冷凍并儲存混合物(113)，
[0023]將儲存的混合物凍干(114)，
[0024]使凍干物交聯(115)，
[0025]形成微顆粒(12)，
[0026]制備聚合物的水溶液(121)，
[0027]制備磷脂、抗氧化劑和醇混合物(122)，
[0028]將水溶液添加到醇混合物上并且混合(123)，
[0029]噴霧干燥所得到的全部混合物(124)，
[0030]將微顆粒與真皮基質系統組合(13)。
[0031]本發明的方法(10)主要基于:分別制備真皮基質系統和微顆粒系統，其后將微顆粒噴灑到真皮基質上，從而將這兩個系統物理組合。
[0032]根據本發明的方法(10)，首先通過將膠原蛋白添加到酸性酸溶液中制備膠原蛋白溶液(111)，從而制成真皮基質系統(11)。在本發明的優選應用中，將牛膠原蛋白以0.1%的濃度添加至0.1M的酸性酸溶液中(111)。
[0033]接下來，將層粘連蛋白添加到膠原蛋白溶液上(112)。在本發明的優選實施方式中，取2.5ml已制備的膠原蛋白溶液，添加20μ1層粘連蛋白，并且將其全部在冰浴中混合
(112)。當使用冰浴時，其目的在于防止存在于混合物內的蛋白質結構劣化。在本發明的優選實施方式中，用10-G探針以3000轉/分鐘的速度進行混合1分鐘。
[0034]將包含膠原蛋白和層粘連蛋白的混合物在-20±1°C的溫度下擱置12小時并冷凍
(113)。在此之后，對已冷凍的所述混合物進行24小時的凍干(114)。由此確保防止所述混合物內的熱敏性生物材料劣化。
[0035]利用紫外交聯儀(UV交聯儀)設備在254nm波長下對已獲得的包含膠原蛋白和層粘連蛋白的凍干結構物進行交聯(115)。在另一處，為了提供微顆粒的形成(12)，制備聚合物水溶液(121)。為了確保這一點，使用0.2g透明質酸鈉鹽(HA)并將其溶于150ml純水中。在此期間，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和白藜蘆醇混合在醇中并溶解(122)。在本發明的優選實施方式中，將0.7g?0.75g的DPPC和0.05g?0.lg白藜蘆醇350ml添加到乙醇中并混合(122)。使用白藜蘆醇(抗氧化劑)顯示出與形成蛋白結構物的膠原蛋白和層粘連蛋白的協同作用，并因此提高了最終產物對于組織修復的效率。此外，確保了長時間保持最終產物的基質完整性。
[0036 ] 將已制備的HA溶液(121)添加到DPPC和白藜蘆醇的醇溶液(122)上并在40 ± 1°C混合(123)。將已制備的全部混合物置于噴霧干燥器中，并且通過噴霧獲得微顆粒(124)。在本發明的優選實施方式中，已調節噴霧干燥器以使初始溫度為180°C，且噴霧速度為400L/h。
[0037]將用噴霧干燥器制備的負載有白藜蘆醇的HA微顆粒作為干粉噴到預先制備的真皮基質(11)上，并且將所述兩個系統組合(13)。根據本發明優選實施方式，噴灑的微顆粒包括50μΜ白藜蘆醇。已獲得的這些基質特別用于慢性創傷治療，并且其