口炎清活性成分群及其指紋特征圖譜的構建和質量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及口炎清制劑的活性成分分析及質量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 中藥的生物活性評價與其安全性、有效性直接相關，中藥的藥效物質基礎是中藥 中與生物活性密切相關的化學成分群，因此對中藥的生物活性成分的研究，闡明其藥效物 質基礎是促進中藥發展和應用的必經之路。早在2004年，美國FDA的《植物藥研制指導原則》 就明確指出，研究植物藥應在已知成分的基礎上提高和藥物作用的研究，運體現了對中藥 的生物活性成分監控的重要性，表明對中藥生物活性成分的研究已成為中藥走向現代化的 關鍵技術。將含有化學特征信息的中藥指紋圖譜與藥效相關聯，分析化學成分變化與藥效 變化的關聯性，能夠科學地掲示生物活性成分，闡明藥效物質基礎，是中藥質量控制的一個 重大進步，在加速中藥現代化的進程中發揮著至關重要的作用。
[0003] 口炎清顆粒是由廣州白云山和記黃捕中藥有限公司獨家生產的治療口腔炎癥疾 病的超億元中成藥。該產品由山銀花、玄參、麥冬、天冬、甘草5味藥材組成，可滋陰清熱、解 毒消腫，臨床用于治療陰虛火旺的口腔炎癥疾病，對復發性口腔潰瘍、口腔黏膜炎、口腔扁 平苔薛、碟口瘡等多種口腔黏膜疾病均有良好療效。口炎清顆粒收錄在《國家基本藥物目 錄》(2012年版），是6個治療咽喉、口腔病的國家基本用藥之一。自1989年上市銷售后，口炎 清顆粒臨床用藥效果顯著，安全性高，一直深受醫生和患者歡迎，帶來了很大的社會效益和 經濟效益。
[0004] 口炎清顆粒HPLC指紋圖譜技術于2012年獲得國家發明專利授權，公開號為 101518616B。該指紋圖譜共檢出23個共有峰，確證了7個已知成分，同時監測了山銀花、玄 參、甘草3味藥材，但麥冬和天冬的相關特征成分研究尚未完善。該指紋圖譜方法不足之處 在于：（1)指紋圖譜所提供的化學信息及化學解釋均較少，共檢出23個共有峰，確證了 7個已 知成分，僅監測了山銀花、玄參、甘草3味藥材，而未檢測麥冬和天冬的相關特征成分。（2)指 紋圖譜中的各特征峰所對應化學成分的生物活性不明確，不能有效監控口炎清顆粒有效成 分含量，無法確保產品的安全性及有效性。
[000引綜上所述，現有口炎清顆粒指紋圖譜構建方法尚存在較多不足，在進一步完善其 化學信息的基礎上，需重點關注其中的核屯、活性成分群，并完善質量檢測手段。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服上述現有技術中的不足，用超快速高效液相色譜儀與四級 桿-飛行時間質譜儀串聯檢測技術對口炎清制劑抗炎藥效的活性成分進行分析，進一步構 建了指紋特征圖譜和活性成分群，并提供了相關質量檢測方法。
[0007] 口炎清制劑抗炎藥效的活性成分的分析及其指紋特征圖譜的構建方法，包括W下 步驟：
[0008] (1)通過體外炎癥模型篩選抗炎藥效學檢測指標；
[0009] (2)在口炎清制劑配方比例約束下，W五味原藥材的質量百分含量為五個因素，均 勻設計構建若干口炎清制劑差異樣品；
[0010] (3似補骨脂素為內標校正，用超快速高效液相色譜儀與四級桿-飛行時間質譜儀 串聯技術，獲得所述差異樣品及原配方口炎清制劑已確證化學成分的相對峰面積，構建指 紋特征圖譜；
[0011] (4)針對步驟（1)所篩選的抗炎藥效學檢測指標，分別獲得所述差異樣品的抗炎藥 效特征數據；
[0012] (5)利用數理統計方法綜合分析步驟(3)所述化學成分與各差異樣品抗炎藥效差 異的關聯性，確定所述口炎清制劑抗炎藥效活性成分群。
[0013] 所述的抗炎藥效學檢測指標分別為促炎因子TNF-a、比-8、比-6、比-10的含量。
[0014] 口炎清制劑差異樣品的若干數量應符合統計學要求，科學合理反映實驗結果。
[0015] 所述步驟(5)中具體方法為W步驟(3)所指證的特征峰的相對峰面積為自變量，W 差異樣品的抗炎藥效為因變量，利用灰色關聯分析或主成分分析或偏最小二乘法綜合分析 兩變量間關聯性，W確定所述口炎清制劑抗炎藥效活性成分群。
[0016] 其中，步驟(3)所述日炎清制劑差異樣品進樣品的制備方法為:按照《中華人民共 和國藥典》2010年版口炎清顆粒標準生產工藝制備各差異樣品浸膏;取適量浸膏加入50% 甲醇9mL，超聲30min，補充50 %甲醇定容至IOmL，經0.22皿微孔濾膜過濾后，用50 %甲醇稀 釋，使終濃度為0.15g/mL，得目標樣品；
[0017] 所述技術的檢測條件為:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，ISOmmX 4.6mm，3皿，柱溫40°C; WO. 1 %甲酸乙臘溶液-0.1 %甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，0-7分 鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由2%變至10%，7-95分鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由10%-41 % ,95-105分鐘，0.1 %甲酸乙臘溶液由41%變至100% ,105-115分鐘，0.1%甲酸乙臘溶液為 100%，流速為0.3mL/min;進樣量為扣L，質譜工作參數:離子噴霧電壓為5500V;離子源氣體 1為55psi ;離子源氣體2為55psi ;溫度為550°C;氣簾氣為35psi ;碰撞氣體壓力為IOpsi ;采 用ESI電噴霧離子源，正離子模式進行檢測。
[0018] 在上述檢測條件下，共檢出相對峰面積大于1.5%的38個特征峰，指紋特征圖譜如 圖2所示;確證1號峰為賴氨酸、2號峰為精氨酸、4號峰為天冬氨酸、5號峰為瓜氨酸、8號峰為 白屈菜酸、10號峰為酪氨酸、11號峰為苯丙氨酸、12號峰為哈己巧、14號峰為綠原酸、16號峰 為咖啡酸、17號峰為甘草巧、18號峰為異搬皮巧、19號峰為木犀草巧、23號峰為安格洛巧C、 24號峰為異甘草巧、27號峰為哈己俄巧、28號峰為肉桂酸、29號峰為灰拉毛忍冬皂巧乙、31 號峰為川續斷皂巧乙、32號峰為甘草次酸、33號峰為甘草酸、35號峰為費奠皂巧元、36號峰 為甲基麥冬二氨高異黃酬A、37號峰為魯斯可皂巧元、38號峰為麥冬皂巧D;3號峰為k天冬 酷胺、6號峰為T-氨基下酸、7號峰為脯氨酸、9號峰為焦谷氨酸、13號峰為新綠原酸、15號峰 為隱綠原酸、20號峰為3,4-二咖啡酷奎尼酸、21號峰為3,5-二咖啡酷奎尼酸、22號峰為4,5-二咖啡酷奎尼酸、25號峰為W費奠皂巧元為巧元的皂巧1、26號峰為W費奠皂巧元為巧元的 皂巧2、30號峰為灰拉毛忍冬次皂巧甲、34號峰為甘草寧B。
[0019] 再W檢出的38個特征峰的相對峰面積為自變量，W差異樣品的抗炎藥效為因變 量，利用灰色關聯分析或主成分分析或偏最小二乘法綜合分析兩變量間關聯性，構建口炎 清制劑抗炎藥效活性成分的指紋特征圖譜如圖4所示;包括29個特征峰，其中1號峰為賴氨 酸、2號峰為精氨酸、3號峰為天冬氨酸、4號峰為丫-氨基下酸、5號峰為脯氨酸、6號峰為白屈 菜酸、7號峰為焦谷氨酸、8號峰為酪氨酸、9號峰為苯丙氨酸、10號峰為哈己巧、11號峰為新 綠原酸、12號峰為綠原酸、13號峰為隱綠原酸、14號峰為咖啡酸、15號峰為甘草巧、16號峰為 異搬皮巧、17號峰為木犀草巧、18號峰為3,4-二咖啡酷奎尼酸、19號峰為3，5-二咖啡酷奎尼 酸、20號峰為4,5-二咖啡酷奎尼酸、21號峰為安格洛巧C、22號峰為異甘草巧、23號峰為哈己 俄巧、24號峰為肉桂酸、25號峰為甘草次酸、26號峰為甘草寧B、27號峰為甲基麥冬二氨高異 黃酬A、28號峰為魯斯可皂巧元、29號峰為麥冬皂巧D。
[0020] 確定其活性成分群為29個分別為:賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丫-氨基下酸、脯氨 酸、白屈菜酸、焦谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、哈己巧、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、 甘草巧、異搬皮巧、木犀草巧、3，4-二咖啡酷奎尼酸、3，5-二咖啡酷奎尼酸、4，5-二咖啡酷奎 尼酸、安格洛巧C、異甘草巧、哈己俄巧、肉桂酸、甘草次酸、甘草寧B、甲基麥冬二氨高異黃酬 A、魯斯可皂巧元及麥冬皂巧D。
[0021] W上活性成分的指紋特征圖譜可應用于口炎清制劑的質量檢測方法，其特征在于 包括W下步驟：
[0022] (1)對照品溶液的制備:取精氨酸、綠原酸、木犀草巧、魯斯可皂巧元對照品適量， 加50%甲醇制成每ImL含綠原酸50yg，精氨酸、木犀草巧、魯斯可皂巧元各化g的對照品溶 液；
[0023] (2)供試品溶液制備:分別稱取待測口炎清制劑樣品1.3g，置具塞錐形瓶中，加入 50 %甲醇IOmL，精密稱定，超聲30min，放置至室溫，加50 %甲醇補足重量，搖勻，經0.22皿微 孔濾膜過濾后即得；
[0024] (3)運用超快速高效液相色譜儀與四級桿-飛行時間質譜儀串聯對上述對照品及 供試品進行檢測并分別構建圖譜；
[00巧]檢測條件：色譜柱：Dionex Bonded Silica C18(3皿，150mmX4.6mm)，柱溫40°C; 流動相:A為0.1 %甲酸乙臘溶液，B為0.1 %甲酸水溶液j$0-7min(2-10%A)，7-95min(10-41%4)，95-105111111(41-100%4)，105-115111111(100%4)的梯度洗脫;進樣量扣1^;流速0.3血/ min；
[0026] 質譜工作參數：離子噴霧電壓為5500V;離子源氣體1為55psi;離子源氣體2為 55psi;溫度為550°C;氣簾氣為35psi;碰撞氣體壓力為lOpsi。采用ESI電噴霧離子源，正離 子模式進行檢測；
[0027] 所述的指紋特征圖譜如圖4所示為對照特征圖譜，供試品圖譜中應呈現29個與對 照特征圖譜相對應的色譜峰，其中2、12、17、28號峰的保留時間應與精氨酸、綠原酸、木犀草 巧、魯斯可皂巧元對照品色譜峰的保留時間相對應;其余色譜峰的保留時間應與對照特征 圖譜相應色譜峰的保留時間一致為合格品。
[0028] 本發明所述的口炎清制劑是W藥典口炎清顆粒處方為基礎，凡W 口炎清顆粒處方 為基本組分，相似藥效的任何類型制劑的半成品或產品均適合本發明的所述的分析方法及 質量檢測方法，均屬于本發明所保護的范圍之內。本技術的實施應用可為其他中藥復方制 劑的研究提供范例。
[0029] 與現有技術相比。本發明具有如下優點：（1)采用超快速高效液相色譜儀與四級 桿-飛行時間質譜儀串聯化化C-Q-T0F-MS/MS)技術研究口炎清制劑的化學成分，確證了指 紋圖譜中25個化學成分，比原專利技術多確證了 18個化學成分；（2)篩選穩定、靈敏的藥效 學檢測指標對口炎清差異樣品進行考察，更全面、客觀科學和直接地反映藥品的藥效作用 特點；（3)本發明中利用香煙煙霧提取物刺激口腔黏膜角化細胞建立體外炎癥模型進行藥 效學實驗，該模型靈活、快速、實驗周期短，是抗炎藥物藥效篩選實驗常用模型；（4)本發明 中綜合運用數理統計方法如灰色關聯分析、主成分分析、偏最小二乘法等方法進行譜效分 析，有效避免自變量間共線性，分析結果直觀、真實、可靠；（5)通過譜效結合分析明確了口 炎清制劑核屯、抗炎活性成分群，闡明了其藥效物質基礎，有效結合了指紋圖譜化學信息與 生物學信息，有利于提高其安全性、有效性及質量均一性。（6)用于口炎清制劑的質量檢測 更快捷和有效。
【附圖說明】
[0030]圖1是口炎清制劑原配方及差異樣品1-11號的UFLC-Q-T0F-MS/MS圖譜；
[0031 ]圖2是口炎清制劑抗炎活性成分群的UFLC-Q-T0F-MS/MS指紋特征圖譜，圖中標女 為內標補骨脂素；
[0032]圖3是口炎清制劑抗炎藥效活性成分的指紋特征圖譜；
[0033 ]圖4是圖3中1號到6號特征峰的局部放大圖；
[0034] 圖5是圖3中7號到10號特征峰的局部放大圖；
[0035] 圖6是圖3中21號特征峰的局部放大圖；
[0036] 圖7是圖3中23到27號特征峰的部分放大圖；
[0037] 圖8是圖2的1號到26號特征峰的局部放大圖；
[0038] 圖9是圖2的27號到39號特征峰的局部放大圖。
【具體實施方式】
[0039] W下通過具體的實施例對本發明作進一步說明。
[0040] 一、口炎清顆粒抗炎藥效學檢測指標的篩選。
[0041 ] 1、實驗材料
[0042] 1.1實驗藥品與試劑
[0043] 口炎清浸膏（廣州白云山和記黃捕中藥有限公司，批號：20140515),牛黃解毒片 (NP,北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號：13121398)，地塞米松(Dex，中國藥品 生物制品檢定所，批號：100129-201105 )，香煙（挪樹牌，廣東中煙工業有限公司），MTT (sigma，M2128-lG)，TNF-a、比-8、比-6、化-10 Elisa試劑盒（武漢優爾生公司），RPMI-1640 培養基化yclone)。
[0044] 1.2實驗儀器
[004引凈化工作臺：蘇州凈化安泰技術有限公司HT-840型;光學顯微鏡:Motic AE21;C02 培養箱:FORMA Seris 303792-6714型；超低溫冰箱:海爾BCD-568W;十萬分之一電子天平： Sartorius BP211D;電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公