復合生物活性因子的提純濃縮方法及濃縮液的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種復合生物活性因子的提純濃縮方法及濃 縮液。
【背景技術】
[0002] 對于人體組織損傷導致的功能障礙，傳統的修復方法是自體組織移植術，自體組 織移植術會犧牲自體健康組織，并且會導致很多并發癥及附加損傷。
[0003] 組織工程指在體外構建人工組織器官，例如，通過對人源或者動物源的細胞在組 織工程培養液中進行原代培養、傳代培養并大量擴增，構建人工組織器官。對于人體組織損 傷，通過人工組織器官作為修復材料，可以達到較好的修復效果，并且避免了自體組織移植 術的各種缺點。
[0004] 體外構建人工組織器官過程中，細胞可以自分泌和旁分泌氨基酸、多肽或蛋白質 等多種生物活性因子到培養液中，形成組織工程皮膚條件培養液。常見的細胞分泌的生 物活性因子有hEGF(中文：人表皮生長因子，英文：humanepidermalgrowthfactor), FGF(中文：成纖維細胞生長因子，英文：fibroblastgrowthfactor),VEGF(中文：血管內皮 生長因子，英文：vascularendothelialgrowthfactor)等。
[0005] 包含多種生物活性因子的組合體可以稱為復合生物活性因子。復合生物活性因子 除了具備各種生物活性因子自身的功能外，各種生物因子之間還可以相互促進，所以，復合 生物活性因子在醫療和化妝品等行業具有重要作用。
[0006] 組織工程皮膚條件培養液中除了包含有用的復合生物活性因子之外，還包含多種 雜質，而且，復合生物活性因子的含量相對于雜質的含量比較低，所以，為了有效利用復合 生物活性因子，對于復合生物活性因子的提純和濃縮就變得非常重要。
[0007] 但是，現有技術提供的提純和濃縮技術一般僅適用于單種生物活性因子，例如，陽 離子交換層析方法，對種類繁多的復合生物活性因子進行提純濃縮的效率和產率較低。
【發明內容】
[0008] 本發明的主要目的在于，提供一種復合生物活性因子的提純濃縮方法及濃縮液， 提高對復合生物活性因子提純濃縮的效率和產率，且工藝簡單，方便實現。
[0009] 為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] -方面，提供一種復合生物活性因子的提純濃縮方法，包括：
[0011] 提供包含所述復合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養液；
[0012] 對所述組織工程皮膚條件培養液進行除雜處理，以除去所述組織工程皮膚條件培 養液中分子量大于30kD的物質，獲得包含所述復合生物活性因子的中間液體；
[0013] 用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，截留所述中間液體中分子量大于3kD 的物質，獲得包含所述復合生物活性因子的濃縮液。
[0014] 進一步的，所述復合生物活性因子包括：hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、 IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
[0015] 可選的，所述提供包含所述復合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養液，具體 包括：
[0016] 收集組織工程皮膚條件培養液；
[0017] 將收集的組織工程皮膚培養液密封后凍存；
[0018] 取需要量的組織工程皮膚條件培養液進行化凍，獲得包含所述復合生物活性因子 的組織工程皮膚條件培養液。
[0019] 可選的，對所述組織工程皮膚條件培養液進行除雜處理，具體包括：
[0020] 將所述組織工程皮膚條件培養液在〇· 9-1. 8bar的壓力下，通過第一切向流超濾 濃縮組件，收集透過液，獲得所述中間液體。
[0021] 優選的，在對組織工程皮膚條件培養液進行除雜處理之前，還包括：
[0022] 將所述組織工程皮膚條件培養液在4000rpm-8000rpm轉速下離心。
[0023] 優選的，所述第一切向流超濾濃縮組件的規格為30kD或者50kD。
[0024] 進一步的，所述對所述組織工程皮膚條件培養液進行除雜處理的步驟，在將所述 組織工程皮膚條件培養液在〇. 9-1. 8bar的壓力下，通過第一切向流超濾濃縮組件的過程 中，還包括：對未透過所述第一切向流超濾濃縮組件的組織工程皮膚條件培養液進行洗濾， 其中，未透過第一切向流超濾濃縮組件的組織工程皮膚條件培養液包括：被第一切向流超 濾濃縮組件截留的組織工程皮膚條件培養液，以及尚未處理的組織工程皮膚條件培養液。
[0025] 可選的，所述用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，具體包括：
[0026] 將所述中間液體在0. 9-1. 8bar的壓力下，通過第二切向流超濾濃縮組件進行濃 縮，收集滯留液，在滯留液的體積為所述中間液體的1/10-1/20時，停止操作；所述滯留液 是指未透過超濾濃縮組件的液體。
[0027] 將所述收集的滯留液在0. 9-1. 8bar的壓力下，再次通過所述第二切向流超濾濃 縮組件，在滯留液的體積為所述中間液體的1/50-1/100時，停止操作，收集滯留液，得到包 含所述復合生物活性因子的濃縮液。
[0028] 優選的，所述第二切向流超濾濃縮組件包含3-5塊串聯分布的超濾膜包，所述超 濾膜包的規格為3kD。
[0029] 另一方面，本發明實施例提供一種濃縮液，包括：hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、 TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
[0030] 本發明實施例提供的一種復合生物活性因子的提純濃縮方法，工藝簡單，實現方 便，能夠對成分復雜的組織工程皮膚條件培養液中的多種生物活性因子同時提純和濃縮， 提高對種類繁多的復合生物活性因子提純濃縮的效率，且獲得的復合生物活性因子純度 高，包含的生物活性因子種類多。
[0031] 本發明實施例提供的濃縮液，包含9種生物活性因子，可以有效的與皮膚細胞發 生作用，促進上皮細胞的營養代謝，預防皮膚受到紫外線、自由基等侵害，還可以促使真皮 層膠原細胞的增生。因此對皮膚術后可以加速修復，并具有撫平細紋，延緩皮膚老化等功 能。
【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0033] 圖1為本發明實施例提供的一種超濾濃縮裝置的結構圖；
[0034] 其中，1為原液桶，2為進口端，3為蠕動泵，4為調壓閥，5為進口端壓力表，6為切 向流超濾濃縮組件，7為回流端壓力表，8為透過端，9為濾液桶，10為回流端。
【具體實施方式】
[0035] 現將詳細地提供本發明實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每 一實例作為解釋而非限制本發明。實際上，對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可以對 本發明進行多種修改和變化而不背離本發明的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部 分而說明或描述的特征可以用于另一實施方式中，來產生更進一步的實施方式。因此，基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0036] 本發明實施例所涉及的材料均可以通過商業途徑或通過申請人獲取。
[0037] 本發明實施例提供了一種復合生物活性因子的提純濃縮方法，包括步驟：
[0038] 步驟1、提供包含復合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養液；
[0039] 步驟2、對該組織工程皮膚條件培養液進行除雜處理，以除去所述組織工程皮膚條 件培養液中分子量大于30kD的物質，獲得包含復合生物活性因子的中間液體；
[0040] 步驟3、用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，截留所述中間液體中分子量大 于3kD的物質，獲得包含復合生物活性因子的濃縮液。
[0041] 通過步驟1至步驟3,能夠對成分復雜的組織工程皮膚條件培養液中的多種生物 活性因子同時提純和濃縮，提高對種類繁多的復合生物活性因子提純濃縮的效率，且獲得 的復合生物活性因子純度高，包含的生物活性因子種類多。
[0042] 下面對本發明實施例的具體實現方式和優選實現方式進行說明。
[0043] 組織工程皮膚為一種組織化工程組織。組織工程皮膚條件培養液是指在基本培養 基中添加其他輔助成分（例如，血清等），采用組織工程方法在體外構建組織工程皮膚后， 包含除組織工