一種生物相容性好、可降解的柞蠶絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學材料領域，具體說涉及一種組織工程生物材料，尤其是一種生物相容性好、可降解的柞蠶絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]組織和器官的衰竭、損傷是最主要的臨床醫學問題，而目前的治療方法主要是器官移植、外科修復、人工取代物，這些方法雖然能起到一定的作用，但它們都存在這樣或那樣的不足，如器官移植是以犧牲健康組織為代價的“以傷治傷”的方法;現有人工取代物存在生物相容性的問題。直到20世紀80年代，美國學者提出了組織工程再生醫學，它是利用生命科學和工程科學的原理和方法，研究和開發用于替代組織或器官的一部分或全部功能的取代物。組織工程的發展，提高了組織工程組織和器官的衰竭、損傷的治療水平，改善了患者的生活質量，有效地降低醫療成本。它集生物工程、生命科學、材料科學與工程及臨床醫學于一體，目的是修復和再生受損組織或器官，幫助病人恢復受損組織的功能，提高生活質量。其基本原理和方法是將體外培養的高濃度組織細胞擴增后吸附于一種生物相容性良好，并可被人體逐步降解吸收的細胞外基質(ECM)材料上，形成細胞-生物材料復合物。該材料可為細胞提供生存的三維空間，有利于細胞獲得足夠的營養物質、進行新陳代謝，使細胞按預制形態的三維支架生長，然后將這種復合體植入機體所需部位。種植的細胞在生物支架降解吸收過程中，繼續增生繁殖，形成新的具有原來特殊功能和形態的相應組織和器官，從而可達到修復組織外形和功能重建的目的。
[0003]組織工程學研究的主要科學問題之一是可供細胞進行生命活動的支架材料以及細胞與支架材料的相互作用，核心是建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體。理想的生物材料在組織工程中起關鍵作用，并成為組織工程研究的主流。生物材料的研究經歷了第一代惰性材料，第二代具有活性或具有降解性質的材料，現已發展到兼有可降解和生物活性的第三代生物材料。人們開始從生命科學的角度研究和設計生物材料，注重材料與細胞的相互作用，改變以往采用惰性材料的作法，將生物的某些功能引入材料。目前，組織工程中的天然生物材料主要是膠原蛋白，人工合成的替代物主要是聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)。要獲取理想的天然支架材料有一定困難，而且也存在一些問題，如膠原蛋白的抗原性強、力學強度不夠，在處理過程中膠原蛋白容易變性等；人工合成的替代物雖然也具有可生物降解特點，如美國FDA認可的體內植入材料，已被制成可吸收的縫線、夾板、螺釘及敷料等，但這些材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面還需改進。因此，目前研究的著重點更多的是尋找可人工合成、生物相容性好、可降解的支架材料。
[0004]作為組織工程的第三代生物新材料，絲蛋白纖維材料因具有獨特的機械特性和生物相容性，以及其本質是蛋白質的結構特點，引起了國內外生物材料界的極大關注。美國、日本、韓國、意大利等國的多個生物醫用材料研究組近年逐漸將研究重點轉向蠶絲蛋白材料，近年來成為在組織工程領域人們重新感興趣的一類特殊的生物材料。
[0005]蠶分為家蠶(桑蠶)和野蠶(柞蠶、天蠶、蓖麻蠶、擂蠶等)兩類，迄今被工業化利用的只有家蠶繭和柞蠶繭兩種，在絕大部分的絲素蛋白材料的研究或報道中，所用原料都是家蠶絲。
[0006]柞蠶絲作為一種用野外放養蠶繅制的天然蛋白質纖維，雖與桑蠶絲一樣是由18種氨基酸組成，但近年來的研究表明，柞蠶絲含有特殊的精氨酸一甘氨酸一天門冬氨酸(RGD)三肽序列，R⑶序列作為細胞膜整合素受體與細胞外配體相結合的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用，能夠促進支架對細胞的黏附[15]，使得細胞在柞蠶絲素膜上的附著率和增殖率遠優于桑蠶絲素膜上的附著率和增殖率，被視為新型的可用于人體的理想的生物和醫學材料。由于柞蠶絲素一級結構中含有較多的細胞特異性粘附序列RGD，而家蠶絲素蛋白中不含R⑶序列，因此，柞蠶絲素蛋白材料的生物學性能可能比家蠶絲素蛋白材料更好。
[0007]而且我國年產柞蠶繭3-4萬噸，占世界柞蠶繭總產量的90%以上，這是世界稀有、我國特有的寶貴資源，但目前柞蠶絲主要用作普通的紡織原料，所體現出的經濟價值十分有限。如果能用柞蠶絲素蛋白制備生物醫用材料，則預計能夠達到家蠶絲素蛋白材料需要進行修飾、接枝等化學加工才能達到的組織相容性效果，這樣既不損失蠶絲蛋白材料現有的優良性能、不產生毒副作用，又節省成本。因此開展對柞蠶絲素蛋白材料的研究，是我國科技工作者的責任。
【發明內容】
[0008]本發明提供一種生物相容性好、可降解的柞蠶絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法。其中柞蠶絲素蛋白所占的質量百分比為55-95%，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5%。
[0009]為實現本發明的目的所采用的技術方案有:致孔劑法、冷凍干燥法、靜電紡絲方法等，具體工藝如下:
致孔劑法:
1.配制支架制備液:取一定量的柞蠶絲素蛋白和高聚物分別溶解于硫氰酸鈉、硫氰酸銨、氯化鈣、硝酸鈣、硫氰酸鋰溶液或甲酸、乙酸、乙醇、氯化鋰、六氟異丙醇等溶劑中，然后將兩種溶液按照一定比例混合，得到含柞蠶絲素蛋白和高聚物的支架制備液。其中柞蠶絲素蛋白所占的質量百分比為55-95%，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5%。
[0010]2.添加致孔劑:加入致孔劑，如氯化鈉，混勻。
[0011]3.倒模、加熱:將添加有致孔劑的支架制備液倒入模具中，置于55_90°C烘箱10-60min形成支架。
[0012]4.變性:將支架浸泡在變性劑溶液(如乙醇沖變性10-15小時后取出，置于蒸餾水浸洗8—12小時。
[0013]5.烘干:將支架于40°C烘干，即得多孔支架材料。
[0014]冷凍干燥法
1.配制支架制備液:取一定量的柞蠶絲素蛋白和高聚物分別溶解于硫氰酸鈉、硫氰酸銨、氯化鈣、硝酸鈣、硫氰酸鋰溶液或甲酸、乙酸、乙醇、氯化鋰、六氟異丙醇等溶劑中，然后將兩種溶液按照一定比例混合，得到含柞蠶絲素蛋白和高聚物的支架制備液。其中柞蠶絲素蛋白所占的質量百分比為55-95%，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5%。
[0015]2.倒模、加熱:將支架制備液倒入模具中，置于55-90°C烘箱10-60min形成支架。
[0016]3.變性:將支架浸泡在變性劑溶液(如乙醇沖變性10-15小時后取出，置于蒸餾水浸泡8—12小時。
[0017]4.冷凍干燥:將支架于_70°C冷凍干燥2小時以上，即可得多孔復合支架材料。
[0018]靜電紡絲方法
1.配制靜電紡絲液:取一定量的柞蠶絲素蛋白和高聚物分別溶解于硫氰酸鈉、硫氰酸銨、氯化鈣、硝酸鈣、硫氰酸鋰溶液或甲酸、乙酸、乙醇、氯化鋰、六氟異丙醇等溶劑中，然后將兩種溶液按照一定比例混合，得到含柞蠶絲素蛋白和高聚物的靜電紡絲液。其中柞蠶絲素蛋白所占的質量百分比為55-95%，生物可降解的高聚物所占的質量百分比為45-5%。
[0019]2.將靜電紡絲液吸入注射器中，注射器插入噴射口中。
[0020]3.將電紡絲發生裝置中的接收板與高壓發生裝置相連，調節電壓至2k?100kV，使噴射口與接收板之間產生高壓靜電。
[0021 ] 4.通過恒流栗將注射器中的靜電紡絲溶液按照一定的流速擠出，噴射流在高電場的作用下被迅速拉細，溶劑也迅速揮發，最終形成直徑在納米級的纖維，并以隨機的方式散落在收集裝置上，形成復合納米纖維無紡布。其中納米纖維的直徑和形態可以通過改變溶液性質(粘度、彈性、電導率、表面張力等)、控制變量(毛細管中的流體靜壓、管口的電勢及其與收集器之間的距離)和環境參數(溶液溫度、空氣的濕度、溫度和空氣流速)進行調節。
[0022]本發明中生物可降解的高聚物是指聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氰代丙烯酸酯、聚己內酯、聚對二氧雜環己酮及其共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚羥基丁酸、其它線性脂肪族聚酯、聚氨基酸、甲殼素、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚氧乙烯中一種或它們的組合。
[0023]本發明的有益效果是:
1.由于柞蠶絲素蛋白是天然蛋白質高分子材料，且具備R⑶序列，因此其制得的支架材料具備很好的生物相容性以及細胞黏附性。
[0