抗butyrophilin-3人源化抗體及其使用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學生物技術和人源化抗體研究領域。本發明涉及對人butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)的抗原決定簇具有特異性識別的人源化抗體分子和包含所述抗體分子及其片段的組合物。本發明還涉及人源化抗butyrophilin-3抗體在治療各種疾病中的用途。
【背景技術】
[0002]人的butyrophilin-3 (嗜乳脂蛋_3)基因家族位于6號染色體MHC I類分子基因簇的延伸端，最初稱為MHC相關基因。Butyrophilin-3家族包含三個成員:BTN3A1，BTN3A2，BTN3A3。Butyrophilin-3基因在小鼠上缺失。Butyrophilin-3蛋白是單次穿膜蛋白，其胞外區結構屬于免疫球蛋白超基因家族，包含有一個N端的IgV樣結構域，和一個近膜端的IgC樣結構域。BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3的胞外區氨基酸組成上高度同源，其中IgV樣結構域的同源性達99-100%。因此,針對IgV樣結構域的抗butyrophilin-3抗體通常能同時識別BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3，因此它是抗-BTN3A1人源化抗體、抗-BTN3A2人源化抗體和抗-BTN3A3人源化抗體的總稱。
[0003]BTN3A1表達于人類各種腫瘤細胞膜表面，如非小細胞肺癌、肝細胞肝癌、胃癌、胰腺腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、急性原髓樣白血病、慢性髓樣白血病、多發性骨髓瘤、紅白血病、骨髓瘤細胞、滑膜肉瘤、軟骨肉瘤等。
[0004]針對腫瘤細胞膜表面BTN3A1的抗體能夠抑制腫瘤細胞的生長和誘導腫瘤細胞微管蛋白的解聚。因此開發一種人源化抗butyrophilin-3抗體能夠有效地治療多種腫瘤。
【發明內容】
[0005]本發明是基于所獲得的一株具有與人butyrophilin-3蛋白特異性結合的親本抗人butyrophilin-3鼠單克隆抗體6D9,通過克隆、鑒定與基因結構的分析,確定了其⑶R區序列，構建了相應的人源化抗體及其真核細胞表達載體，并獲得了表達并分泌該抗人butyrophilin 3人源化抗體的細胞株,生產純化了該人源化抗體。
[0006]本發明研發了針對butyrophilin-3蛋白IgV樣結構域的人源化抗體，命名為Xylizumab (再力助單抗)，發現Xylizumab能夠識別BTN3A1，BTN3A2和BTN3A3三個蛋白，其結合的表位位于butyrophilin 3蛋白IgV樣結構域。
[0007]Xylizumab能夠抑制20種人類腫瘤細胞系的生長，這些細胞系覆蓋了上皮來源的癌癥細胞如非小細胞肺癌細胞系(Calu-Ι)、肝細胞肝癌細胞系(Huh7，HepG2)、胃癌細胞系(MGC80-3)、胰腺腺癌細胞系(PANC-1, BxPC-3, CFPAC-1)、乳腺癌細胞系(SKBR3)、卵巢癌細胞系(SK0V3)、宮頸癌細胞系(HeLa);血液系統腫瘤，如急性原髓樣白血病細胞系(HL-60, NB4)、慢性髓樣白血病細胞系(K-562)、多發性骨髓瘤細胞系(U266，KM3)、紅白血病細胞系(HEL);肉瘤，如骨髓瘤細胞系(U-2 OS, MNNG/H0S)、滑膜肉瘤細胞系(SW982)、軟骨肉瘤細胞系(SW1353)。但它對正常細胞系HFLl沒有表現出抑制作用。Xylizumab能夠誘導某些腫瘤細胞凋亡，這種現象對于HL-60細胞特別明顯，并且Xylizumab能夠完全抑制HL-60的生長。
[0008]Xylizumab介導的腫瘤生長抑制是通過抗體與細胞膜上的BTN3A1結合后，來向胞內傳遞生長抑制信號的。Xylizumab在正常濃度10ug/ml的水平下就能發揮抑制效應，當培養體系中濃度增加至500ug/ml的時候,它能誘導細胞內微管蛋白解聚。
[0009]動物實驗顯示Xylizumab能夠減緩移植性肝癌IfepG2和移植性骨肉瘤MNNG/HOS的生長，延長裸鼠的生存期。
[0010]另外，這個抗體能夠抑制骨髓來源的原代急性髓性白血病M3和M4的細胞克隆形成，這說明該抗體能夠治療某些原代血液系統腫瘤。
[0011]由于BTN3A1廣泛表達于幾乎所有類型腫瘤細胞系中，所以BTN3A1能夠做為不同類型腫瘤的共同革G標。Xylizumab能夠通過與細胞膜上的BTN3A1結合來介導胞內微管解聚，這項功能的發現豐富了我們對抗體功能的認識，也拓展了抗體的應用范圍。利用抗體的這一新功能，可以動態可逆地調節微管的聚合，并且以這個抗體為基礎的免疫治療也會具有廣闊的應用前景。
[0012]因此，本發明主要涉及了以下幾個方面:
第一方面，本發明涉及一種抗人butyrophi I in-3人源化抗體,其中所述人源化抗體由含有3個輕鏈可變區的輕鏈和含有3個重鏈可變區的重鏈組成，其中所述3個輕鏈可變區CDR 的氨基酸序列為 QSLSDN (SEQ ID NO:1)、FAS (SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ IDNO:3)，重鏈可變區 CDR 的氨基酸序列為 GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。本領域公知，抗體的結合特異性及親合力均主要由CDR序列決定，根據成熟、公知的現有各項技術可輕易地將非CDR區域的氨基酸序列改變而獲得具有相類似的生物活性的變體。本發明涉及的具有與上述CDR序列完全相同的CDR序列的單克隆抗體變體，因其具有與本發明所述的人源化抗體完全相同的CDR序列，因此具有相類似的生物活性。
[0013]第二方面,本發明涉及抗人butyrophilin-3人源化抗體的片段,其中該片段選自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、SCFv和抗體最小識別單位組成的組。并且該片段包含了 3個輕鏈可變區的⑶R和3個重鏈可變區的⑶R，其輕鏈可變區⑶R氨基酸序列為QSLSDN (SEQID NO:I) ,FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重鏈可變區 CDR 序列為GFTFSSYA (SEQ ID NO:4)、I SSGGNYS (SEQ ID NO:5)和 ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)。
[0014]第三方面，本發明涉及一種治療疾病的方法，其中所述疾病選自由以下組成的組:腫瘤，如:骨肉瘤、軟骨肉瘤、滑膜肉瘤、甲狀腺髓樣癌(MTC)、結腸直腸癌、肝細胞癌、肝癌、胃癌、食道癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸部癌、膀胱癌、尿路上皮癌、前列腺癌、血液系統腫瘤、淋巴系統腫瘤、胸腺瘤、黑素瘤等；自身免疫性疾病，如:類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、系統性血管炎、自身免疫性肝病、天皰瘡、硬皮病、皮肌炎、混合性結締組織病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺自身免疫病、潰瘍性結腸炎、Crohn氏病、銀屑病、干燥性綜合癥、惡性貧血、新生兒溶血、自身免疫性溶血性貧血、特發性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病、強直性脊柱炎、硬皮病、重癥肌無力、結節性多動脈炎、Wegener肉芽腫病、亞急性細菌性心內膜炎等；免疫排斥性疾病，如宿主抗移植物反應、移植物抗宿主反應、輸血相關性移植物抗宿主病、 過敏性反應等。
【附圖說明】
圖1a是采用ELISA方法證實抗-butyrophilin-3人源化抗體Xylizumab識別從CHO細胞表達純化的BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3。b是采用ELISA方法證實抗-butyrophi I in_3人源化抗體Xylizumab識別的抗原決定簇位于butyrophilin-3蛋白的Ig V結構域。由于butyrophilin-3蛋白的Ig V結構高度同源，因此Xylizumab能夠同時識別BTN3A1、BTN3A2和 BTN3A3。
圖2是Xylizumab抑制裸鼠移植性肝細胞肝癌IfepG2的生長。
圖3是Xylizumab抑制裸鼠移植性骨肉瘤MNNG/H0S的生長。
圖4是Xylizumab延長移植性肝細胞肝癌HepG2荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=14.36, P<, 0.001)。
圖5是Xylizumab延長移植性骨肉瘤MNNG/H0S荷瘤裸鼠的生存期(log-rank test,Chi square=12.67, P<, 0.001)。
【主權項】
1.一種組合物，其包括包含輕鏈可變區⑶R(互補決定區)序列QSLSDN (SEQ IDNO:1)、FAS(SEQ ID NO:2)和 QQSHSWPYT (SEQ ID NO:3)及重鏈可變區 CDR 序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:4)、ISSGGNYS(SEQ ID NO:5)和ARHGPDDFTSWVDY (SEQ ID NO:6)的人源化抗-butyrophilin-3抗體、單鏈抗體或其抗體片段。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述抗butyrophilin-3人源化抗體包含人抗體IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定區的序列。3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述抗體片段選自由F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和抗體最小識別單位組成的組。5.根據權利要求1所述的組合物，其中抗-butyrophilin-3人源化抗體或其片段是裸抗體或其片段。6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述人源化抗-butyrophilin-3抗體與butyrophilin 3A1 (BTN3A1), butyrophilin 3A2 (BTN3A2), butyrophilin 3A3 (BTN3A3)彡口口。7.根據權利要求6所述,抗-butyrophilin-3人源化抗體是抗-BTN3A1人源化抗體、抗-BTN3A2人源化抗體和抗-BTN3A3人源化抗體的總稱。8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述抗-butyrophilin-3人源化抗體或其片段與至少一種診斷劑和/或治療劑偶聯以形成免疫偶聯物。9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述治療劑選自由以下組成的組:裸抗體、細胞毒素劑、藥物、放射性核素、硼原子、免疫調節劑、光敏性治療劑、免疫偶聯物、寡核苷酸和激素。10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述細胞毒素劑是藥物或毒素。11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述藥物具有選自由抗有絲分裂、烷基化、抗代謝、抗血管生成、細胞凋亡、生物堿、C0X-2抑制劑和抗生素劑組成的組的藥物性質。12.根據權利要求10所述的組合物，其中所述藥物選自由以下組成的組:氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、蒽環霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗代謝物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬配位絡合物、長春花生物堿、經取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、拮抗劑、內皮抑素、紫杉醇、喜樹堿、奧沙利鉬和阿霉素。13.根據權利要求10所述的組合物，其中所述藥物選自由以下組成的組:5_氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽環霉素、苯達莫司汀、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜樹堿、卡鉬、10-羥基喜樹堿、亞硝脲氮芥、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、C0X-2抑制劑、伊立替(CPT-1l)、SN-38、卡鉬、克拉屈濱、喜樹堿、環磷酰胺