長壽果水相提取物的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及長壽果水相提取物的新用途：具體涉及抑制磨損顆粒誘導的組織炎 癥，破骨細胞活性和功能，骨吸收和無菌性松動以及在在制備治療骨質疏松藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 《中國人口老齡化發展趨勢預測研究報告》指出，中國已于1999年進入老齡社會， 至2020年老年人口將達2. 48億人。研究表明，65歲以上人群中，骨關節疾病是導致機體殘 疾的最常見原因，而人口老齡化勢必導致骨關節疾病發生率顯著增加。人工關節置換術是 臨床上治療嚴重骨關節疾病的有效方法，應用日益廣泛，但是假體的無菌性松動仍是導致 人工關節置換術后中遠期失敗的最主要原因，嚴重影響假體使用壽命。目前對于無菌性松 動尚無有效的預防手段，僅能在松動出現后再行翻修手術進行補救性治療，而翻修手術費 用高昂、操作復雜、給患者造成二次創傷、且遠期效果遠不如初次置換。因此尋求新的手段 來預防假體無菌性松動，提高假體使用壽命是目前骨科領域的研究熱點。
[0003] 目前研究認為人工關節松動是由于假體摩擦產生的磨損顆粒通過滑液擴散機制 在有效關節腔內擴散，介導的無菌性炎癥引起破骨細胞前體募集和破骨細胞分化激活，導 致假體周圍骨溶解；而骨溶解又進一步擴大顆粒擴散范圍，從而形成顆粒擴散-骨溶解的 惡性循環所致，其中無菌性炎癥是整個機制的起始反應。關節腔內的磨損顆粒被巨噬細胞 吞噬后激活巨噬細胞，釋放腫瘤壞死因子（TNF-ct )、白介素1β (IL-Ιβ)、白介素6(IL-6) 等一系列炎性細胞因子，引起無菌性炎癥。而慢性持續的局部組織炎癥是引起最終破骨細 胞活性增高，最終導致骨溶解和無菌性松動的最主要原因。因此，有效控制磨損顆粒引起的 慢性組織炎癥，抑制局部破骨細胞活性和分化，才能有效地抑制骨溶解反應從而治療假體 無菌性松動。
[0004] 骨質疏松癥（Osteoporosis, 0P)是一種中老年人最常見的"隱形"疾病。骨質疏 松是以低骨量及骨組織微結構退變為特征的一種全身性代謝性骨疾病，伴有骨脆性增加、 骨強度降低，易發生骨折。隨著人類社會的老齡化，骨質疏松癥發病率在不斷地增加，尤其 是絕經后婦女,骨質疏松癥和骨折并發癥發病率更高。
[0005] 據美國骨質疏松基金會統計，約3000萬美國人患有骨質疏松癥，其中80%為女 性。目前美國用于支付因為骨質疏松而引起的股骨骨折的醫療費用支出就達到140億美 金。中國現已經步入老齡化社會，所以骨折疏松的預防和治療也已經成為一個不容忽視的 問題。因此防治骨質疏松逐漸成為老年人尤其是絕經婦女人群的重要問題。
[0006] 目前對無菌性松動的病人除了做翻修手術外，沒有很好的非手術的藥物治療方 法。其原因之一是缺乏安全或有效的藥物能有效改善假體周圍炎癥，抑制破骨細胞分化和 活性，從而預防早期溶骨反應。目前，臨床上常用于治療骨質疏松癥的藥物主要有：骨吸收 抑制劑如雌激素、雌激素受體調節劑、雙磷酸鹽等；骨形成促進劑如氟制劑、甲狀旁腺激素 除鈣劑、同化激素、他汀類藥物等；骨礦化藥如鈣劑、維生素 D等。上述藥物都缺乏安全或有 效的藥物能有效改善假體周圍炎癥，抑制破骨細胞分化和活性，從而預防早期溶骨反應。
【發明內容】
[0007] 本發明的一個目的在于提供長壽果水相粗提取物抑制磨損顆粒誘導的組織炎癥， 破骨細胞活性和功能，骨吸收和無菌性松動以及在在制備治療骨質疏松藥物中的應用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：
[0009] 長壽果（Pepino (Solanum muricatum Ait))水相提取物在制備預防或/和治
[0010] 療組織炎癥的藥物中的應用。
[0011] 根據權利要求1所述的應用，其中所述的炎癥由磨損顆粒引起。
[0012] 長壽果水相提取物在制備預防或/和治療抑制破骨細胞活性的藥物中的應用。
[0013] 長壽果水相提取物在制備預防或/和治療絕經婦女骨質疏松癥的藥物中的應用。
[0014] 長壽果水相提取物在制備促進骨量增長的藥物中的應用。
[0015] -種用于治療骨質疏松癥的天然藥物組合物，包含有效劑量的長壽果水相提取物 以及一種或多種的可藥用輔料。
[0016] 本發明所述長壽果原料可以從市場購買。長壽果水相粗提取物代表了一類新的具 有廣闊前景的天然活性化學物質。它們毒副作用輕、生物醫學功效高、能選擇性的抑制破 骨細胞生長，分化，和活性，是值得進一步研究開發的新一代抗骨折疏松保健食品及中藥新 藥。其市場前景十分可觀，包括：（1)開發和生產具有抗骨質疏松功能的含有長壽果活性成 分的保健食品；(2)開發研究具有功能療效的中藥第二類準字號藥品；（3)開發以長壽果為 主體的中藥復方制劑。
[0017] 目前市場上沒有具有確切功效的延緩、預防和治療骨質疏松的天然藥物/保健食 品。由於受廣告和媒體的影響，目前公眾所認知的防止骨質疏松的方法是服用各種所謂的 "生物活性鈣"保健品，其市場競爭激烈，市場份額相當可觀，但是其確切功效令人懷疑，因 為骨質疏松的根本原因是由于破骨細胞活性過高所至，而非由於缺鈣。相反，近年由于長期 服用鈣制劑引起的副作用漸漸引起重視，例如并發腎結石等。所以，隨著公眾對骨質疏松發 病機制的進一步了解，人們將會青睞無毒無害具有一定營養價值，同時又具有獨特的調節 破骨細胞功能的天然活性化學物質，例如長壽果天然植物材料。隨著長壽果系列產品的研 制開發，不僅會全面更新目前對骨質疏松預防和治療的概念，而且隨之而帶來的經濟效益 顯而易見。
【附圖說明】
[0018] 圖1 :長壽果水相粗提取物抑制磨損顆粒激活的RAW細胞的NF-B活性；
[0019] 圖2 :長壽果水相粗提取物對磨損顆粒激活的破骨細胞相關基因基因水平的影 響；
[0020] 圖3 :長壽果水相粗提取物抑制了 RANKL誘導的破骨細胞分化；
[0021] 圖4 :長壽果水相粗提取物抑制破骨細胞活性（骨吸收測定）；
[0022] 圖5 :長壽果水相粗提取物對RAW細胞無明顯細胞毒性作用。
【具體實施方式】
[0023] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0024] 1.材料和方法
[0025] I. 1長壽果水相粗提取物的制備：
[0026] 長壽果（Pepino (Solanum muricatum Ait))原料向美國 Exotica Nursery Inc. (Vista，CA92083,USA)購買。將干燥的長壽果原料（包括果實，莖葉）100克，切片，然后加 入500毫升水煮沸3小時。水萃取液然后冷凍干燥。凍干粉末然后再重新懸浮在正丁醇溶 液中萃取三次后再次冷凍干燥，其SM提取物粉末用于以下的實驗。凍干長壽果水相粗提取 物粉末溶解于無血清的Dulbecco改進的Eagle培養基（DMEM)中，制備10毫克/毫升貯備 液冷凍保存。在實驗之前，解凍將其稀釋至用于治療細胞合適的終濃度。
[0027] L 2磨損顆粒制備
[0028] 制備了二種常見磨損顆粒用來刺激炎性反應。超高分子量聚乙烯顆粒（ultra high molecular weight polyethylene, UHMWPE)(由美國阿拉巴馬大學 JohnCuckler 博 士饋贈，也可以在市場上直接購買）。UHMffPE顆粒平均粒徑為3. 6um(范圍從2. Oum至 23um)。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)顆粒購置于美國Polyscience公司，其顆粒平均直徑為 4. Oum(范圍0· Ium到IOum)。磨損顆粒首先通過加入70%乙醇溶液反復洗滌以去除內毒 素，然后再進行高溫消毒。使用的磨損顆粒在使用前均通過鱟血試驗（Endosaf，查爾斯頓， 南卡羅來納，美國）證實沒有內毒素污染。磨損顆粒然后懸浮在無菌PBS中，并儲存在4°C 直至使用。
[0029] I. 3RAW264. 7細胞培養、磨損顆粒刺激以及長壽果水相粗提取物的干擾實驗
[0030] 本研究采用RAW264. 7細胞（來源于小鼠巨噬細胞的細胞系（ATCC，Rockville， MD)來評估長壽果水相粗提取物的效果。RAW264. 7細胞置于Dulbecco改良的Eagle培養 基（DMEM) (Gibco BRL公司，MD)培養液中37°C和5v/v%的CO2條件下培養。DMEM培養液含 ΙΟv/v%胎牛血清（FBS)和抗生素（青霉素-GlOO單位/ml和100微克/毫升鏈霉素）。研 究磨損顆粒對細胞的影響，細胞培養液中加入lv/v%的混合磨損顆粒（PMMA+UHMWPE)。我 們既往研究發現混合磨損顆粒（PMMA+UHMWPE)可以在體外細胞培養模型和體外動物實驗 中，均可誘導最大炎性反應。為研究長壽果水相粗提取物的生物活性，細胞在加入磨損顆粒 之前，先加入不同濃度的長壽果水相粗提取物預先培養三個小時，然后再加入磨損顆粒。
[0031] 1. 4電泳遷移率變動分析（EMSA)
[0032] EMSA檢查用于分析核因子κΒ轉錄因子（nuclear factor kappa B transcription factor, NF-kB)與細胞核內DNA的結合活性。所提取的RAW264. 7細胞的 細胞核蛋白（5微克）與32P標記的NF-kB寡核苷酸5' -GCCATGGGGGGATCCCCGAAGTCC-3'（ Geneka生物技術公司，加拿大）混合后在室溫下置于反應緩沖液（10毫摩爾Tris，pH7. 5， 50mM氯化鈉 ，ImM的DTT，ImM的EDTA，5v/v%甘油）中25分鐘。所形成的DNA-蛋白質復合 物從游離的寡核苷酸上分離后通過在4v/v% (變性聚丙烯酰胺凝膠（含有50mM Tris，pH 值7. 5,0. 38甘氨酸和2mM EDT)電泳分離，然后將凝膠干燥，測定放射自顯影。
[0033] 1. 4實時定量聚合酶鏈反應
[0034] 實時定量PCR反應按照生產商的說明書（Perkin Elmer公 司，應用生物系統公司，福斯特城，加利福尼亞州，美國）進行。使用的 引物如下：NF-kB，5'-GGGGATGTGAAGATGTTG-3'（正向，核苷酸 1846 至 1864)和 5'-CCAAGTGCAGAGGTGTCTGA-3'（反向，核苷酸 2044 至 64); RANK，5'-CGAGGAAGATTCCCACAGAG-3'（正向，核苷酸 1031 至 1051)和 5'-CAGTGAAGTCACAGCCCTCA-3' （反向，核苷酸 1228 至 1248) ;IL-la，5'-ATGGCAACTGTT CCTGAACTCAACT-3'（正向，核苷酸 78-103)