小腸黏膜下層載藥補片及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學工程中藥物釋放系統技術領域，具體涉及一種小腸黏膜下層載藥補片及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]我國每年約有350萬人因不同原因出現骨缺損，骨手術移植約為150萬例，對替代骨的需求量非常大，尤其是大骨骼損傷的替代骨。隨著組織工程技術的快速發展，在體外構建具有成骨傳導性和成骨誘導性的人造替代骨是解決這一需求的重要途徑。骨架材料在組織工程骨構建中起著至關重要的作用。相比于其他合成材料，天然細胞外基質(ECM)材料由于其以下特點:1.優異的生物相容性;2.最接近于體內細胞生長微環境的三維結構;3.為細胞生命活動提供了各種活性分子，一直被認為是理想的組織工程材料。豬小腸黏膜下層(SIS)是目前研究最多的天然細胞外基質材料，已通過美國Π)Α批準，被廣泛用來構建人造膀胱、人造尿道、人造食道、人造血管和人造皮膚等軟組織。SIS材料骨架成分膠原蛋白(collagen)已經被廣泛用來作為骨架材料和藥物載體用于骨組織工程。SIS相比于膠原有兩大優點:1.SIS是個天然的藥物庫，它保留了許多有利于骨再生的生物活性分子;2.SIS在取材上更加便利，成本也要遠低于膠原。國內外用SIS材料作為骨組織工程骨架材料報道已有一些，但是有一個問題使之無法進一步推廣使用:成骨誘導性的不足。通過在SIS上載入具有促進骨再生的藥物，并使之能夠實現緩慢釋放，將可以彌補這一缺陷。如果能解決這個難題，SIS材料將成為理想的骨組織工程材料。
[0003]骨組織工程中所需要的促進骨再生的藥物一直是一個研究熱點，BMP-2蛋白雖然是目前廣泛被認可和采用的最有效的成骨誘導因子，但是由于其非常昂貴，而采用BMP基因導入方法又存在一定的安全問題，因此它的臨床使用還是受到成本和安全性的制約。此外，BMP-2和其他蛋白藥物都存在穩定性差、在體內半衰期短的問題，相應對于藥物釋放體系的要求非常高。因此尋找低成本、穩定又可以高效誘導骨再生的小分子化合物來替代BMP是非常有意義的。目前治療骨質疏松的藥物主要通過抑制骨吸收來實現骨代謝的平衡，但是通過促進成骨細胞分化和骨再生的化合物非常少，非常有限的報道包括:他汀類藥物、異黃酮衍生物、TAK-778和賽菊芋黃素衍生物等。隨著現代分離技術的發展，從天然產物中提取各種化合物，難度和成本都要遠遠低于傳統的化學合成。中藥作為中華名族的瑰寶，記載了大量中草藥對于各種疾病的治療，其有效性也越來越得到世界范圍內的認可。植物藥淫羊藿一直以來被認為具有強筋健骨的作用，其主要活性成分淫羊藿苷在骨代謝中的功能和機制直到最近幾年才開始被逐漸研究。Chen Ke-Ming等人首次發現大鼠骨髓間充質干細胞經過淫羊藿苷處理之后，細胞增殖加速，分化標志物ALP、0CN和礦物化都有增加，表明淫羊藿苷可能具有促進骨代謝的作用。我們的研究發現淫羊藿苷可以通過上調Runx2表達和激活BMP信號通路來促進成骨細胞的分化;Hsieh等人也發現淫羊藿苷通過激活BMP和N0信號通路來促進成骨細胞分化，同時BMP-2、Smad4、Runx2和0PG等基因表達上調。Chung等的研究發現淫羊藿苷可以激活內皮細胞中的MEK/ERK和PI 3K/Akt/eN0S信號通路來加速血管生成;在小鼠臨界骨損傷模型研究中，我們發現淫羊藿苷-磷酸鈣水泥復合材料能夠在6周之后誘導小鼠體內頭蓋骨損傷處形成具有血管的新生骨。淫羊藿苷是一種非常具有潛力的可以用于骨組織工程的藥物。但是目前尚未有在SIS上載入淫羊藿苷作為促進骨再生的緩釋藥物的相關報道。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種具有極強的促骨再生能力的小腸黏膜下層載藥補片。
[0005]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種可操作性強的小腸黏膜下層載藥補片的制備方法。
[0006]本發明所要解決的第三個技術問題是提供一種小腸黏膜下層載藥補片的應用。
[0007]本發明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案為:小腸黏膜下層載藥補片，該載藥補片的微觀結構包括SIS膠原纖維骨架和加載于SIS膠原纖維骨架上的淫羊藿苷，所述的SIS膠原纖維骨架為網狀纖維結構，所述的淫羊藿苷為顆粒狀，所述的淫羊藿苷附著于所述的SIS膠原纖維骨架上，所述的淫羊藿苷的附著量為20?80yg/cm2。
[0008]本發明小腸黏膜下層載藥補片，在SIS膠原纖維骨架上附著顆粒狀的淫羊藿苷，建立穩定的藥物釋放體系，將SIS膠原纖維骨架和淫羊藿苷這兩個極具潛力的骨組織工程元素結合起來，形成的小腸黏膜下層載藥補片復合材料可靠、穩定，對淫羊藿苷安全、經濟、化學性質穩定及優異的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用，該小腸黏膜下層載藥補片具有極強的促骨再生能力，在骨再生領域具有廣泛的應用前景。
[0009]本發明解決上述第二個技術問題所采用的技術方案為:一種小腸黏膜下層載藥補片的制備方法，包括以下步驟:
[0010]1)小腸黏膜下層補片的準備:在無菌環境下，取出干燥無菌的SIS材料，裁剪成所需尺寸的小腸黏膜下層補片，再將裁剪好的小腸黏膜下層補片用去離子水浸潤12?24h使材料充分潤濕，棄去去離子水后用50%的乙醇溶液浸潤1?2h，棄去乙醇溶液后依次換用70%、80%、90%的乙醇溶液和無水乙醇浸潤補片1?2h，最后將小腸黏膜下層補片置于無水乙醇中待用；
[0011 ] 2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在無菌環境下，將粉狀淫羊藿苷加入至二甲亞砜中，混勻震蕩溶解，制得濃度為50mg/mL的淫羊藿苷儲備液;取lmL的淫羊藿苷儲備液，與無水乙醇混合，制得終濃度為0.5?2.5mg/mL的淫羊藿苷工作溶液；
[0012]3)小腸黏膜下層載藥補片的制備:在無菌環境下，從無水乙醇中取出小腸黏膜下層補片，按照400yL/Cm2的用量將淫羊藿苷工作溶液分幾次均勻加載至小腸黏膜下層補片上，每次加載量為lOOyL，兩次加載的時間間隔為30?50分鐘，直至所有淫羊藿苷工作溶液全部加載至小腸黏膜下層補片上，得到小腸黏膜下層載藥補片;將得到的載藥補片置于通風室溫條件24?48h，隨后將載藥補片放入去離子水中并在室溫下搖晃24?48h，棄去去離子水后將載藥補片放入PBS緩沖液中，室溫下震蕩搖晃，每24h棄去舊的PBS緩沖液并加入等量新的PBS緩沖液，連續5天后將載藥補片取出并放入新的PBS緩沖液中，于2?6°C保存備用。
[0013]步驟3)中，淫羊藿苷工作溶液加載至小腸黏膜下層補片的方式包括滴加、噴淋、注射和浸泡中的至少一種。
[0014]本發明解決上述第三個技術問題所采用的技術方案為:上述小腸黏膜下層載藥補片在骨再生中的應用。
[0015]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明小腸黏膜下層載藥補片，在SIS膠原纖維骨架上附著顆粒狀的淫羊藿苷，建立穩定的藥物釋放體系，將SIS膠原纖維骨架和淫羊藿苷這兩個極具潛力的骨組織工程元素結合起來，形成的小腸黏膜下層載藥補片復合材料可靠、穩定，對淫羊藿苷安全、經濟、化學性質穩定及優異的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用，該小腸黏膜下層載藥補片具有極強的促骨再生能力，制備方法簡單，在骨再生領域具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0016]圖1為未加載藥物的SIS膠原纖維骨架的SEM圖片；
[0017]圖2為實施例一的載藥補片的SEM圖片；
[0018]圖3為本發明小腸黏膜下層載藥補片的結構示意圖；
[0019]圖4為實施例一的載藥補片的淫羊藿苷釋放曲線；
[0020]圖5為實施例一的載藥補片體外生物學活性驗證結果；
[0021]圖6為無植入物的空白對照骨的HE染色結果；
[0022]圖7為實施例一的載藥補片組的HE染色結果。
【具體實施方式】
[0023]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0024]實施例一的小腸黏膜下層載藥補片，其微觀結構包括SIS膠原纖維骨架和加載于SIS膠原纖維骨架上的淫羊藿苷，SIS膠原纖維骨架為網狀纖維結構，淫羊藿苷為顆粒狀(顆粒度為0.3?0.6μπι)，淫羊藿苷附著于SIS膠原纖維骨架上，淫羊藿苷的附著量為33.2±5.6yg/cm2，其制備方法包括以下步驟:
[0025 ] 1)小腸黏膜下層補片的準備:在無菌環境下，取出干燥無菌的SIS材料，裁剪成1 cmX lcm的小腸黏膜下層補片，再將裁剪好的小腸黏膜下層補片用去離子水浸潤12?24h使材料充分潤濕，棄去去離子水后用50 %的乙醇溶液浸潤1?2h，棄去乙醇溶液后依次換用70%、80%、90%的乙醇溶液和無水乙醇浸潤補片1?2h，最后將小腸黏膜下層補片置于無水乙醇中待用；
[0026]2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在無菌環境下，將粉狀淫羊藿苷加入至二甲亞砜中，混勻震蕩溶解，制得濃度為50mg/mL的淫羊藿苷儲備液;取lmL的淫羊藿苷儲備液，與無水乙醇混合，制得終濃度為0.5mg/mL的淫羊藿苷工作溶液；
[0027]3)小腸黏膜下層載藥補片的制備:在無菌環境下，從無水乙醇中取出小腸黏膜下層補片，將400yL的0.5mg/mL淫羊藿苷工作溶液分四次均勻加載至小腸黏膜下層補片上，每次加載量為100yL，兩次加載的時間間隔為30?50分鐘，直至400yL淫羊藿苷工作溶液全部加載至小腸黏膜下層補片上，得到實施例一的小腸黏膜下層載藥補片;將得到的載藥補片置于通風室溫條件24?48h，隨后將載藥補片放入去離子水中并在室溫下搖晃24?48h，棄去去離子水后將載藥補片放入PBS緩沖液中，室溫下震蕩搖晃，每24h棄去舊的PBS緩沖液并加入等量新的PBS緩沖液，連續5天后將載藥補片取出并放入新的PBS緩沖液中，于2?6°C保存備用。
[0028]實施例二的小腸黏膜下層載藥補片，其微觀結構包括SIS膠原纖維骨架和加載于SIS膠原纖維骨架上的淫羊藿苷，SIS膠原纖維骨架為網狀纖維結構，淫羊藿苷為顆粒狀(顆粒度為0.3?5μπι)，淫羊藿苷附著于SIS膠原纖維骨架上，淫羊藿苷的附著量為56.2±8.8μg/cm2，其制備方法包括以下步驟:
[0029 ] 1)小腸黏膜下層補片的準備:在無菌環境下，取出干燥無菌的SIS材料，裁剪成1 cmX lcm的小腸黏膜下層補片，再將裁剪好的小腸黏膜下層補片用去離子水浸潤12?24h使材料充分潤濕，棄去去離子水后用50 %的乙醇溶液浸潤1?2h，棄去乙醇溶液后依次換用70%、80%、90%的乙醇溶液和無水乙醇浸潤補片1?2h，最后將小腸黏膜下層補片置于無水乙醇中待用；
[0030]2)淫羊藿苷工作溶液的配制:在無菌環境下，將粉狀淫羊藿苷加入至二甲亞砜中，混勻震蕩溶解，制得濃度為50mg/mL的淫羊