流感疫苗、組合物及使用方法
【技術領域】
[0002] 本發明設及微生物學和病毒學領域。
【背景技術】
[0003] 存在Ξ種類型的流感病毒：甲型、乙型和丙型流感病毒，它們在它們的流行病模式 中差別很大。甲型流感病毒既是被表征最好的，也是對公眾健康威脅最嚴重的，其能夠誘發 大規模的時疫或流行病。該病毒還具有高度變異的抗原性，使得生產有效疫苗很困難。
[0004] 流感疫苗應該是預防疾病W及控制疾病傳播的最有效、安全、無毒和最經濟的武 器。接種疫苗的主要目標是激活適應的特異性免疫應答，主要是要產生針對與疾病或病原 相關的抗原的B和T淋己細胞。 陽〇化]目前可W獲得一些流感疫苗，其主要含有滅活疫苗。運些疫苗可W包含兩種甲型 抗原（例如，H1N1和冊N2)和一種乙型抗原。可得到的疫苗一般含有整個病毒體、分離產 品和亞單位疫苗。一般，運些疫苗如果對新生傳染病的同一性非常匹配的話，它們就會對高 達90%的已接種個體具有效果。然而，它們需要每年進行更新W與流感病毒的抗原性變化 保持同步。
[0006] 此外，最近報道了一種針對季節性流感的冷適應的減毒活鼻內疫苗（LAIV)。關于 感染H1N1菌株的棉花大鼠抵御H3N2病毒的一項研究中描述了交叉保護性免疫。然而，關 于LAIV的一個主要的顧慮是基因翻轉和與野生型流感病毒混種的可能性，其會產生一種 新的、潛在的感染性菌株。
[0007] 本發明致力于解決流感疫苗的運些和其它問題，提供了疫苗和組合物，其使用突 變的博代氏桿菌度ordetella)菌株作為有效成分試劑，來誘發針對一種或多種流感菌株 的免疫應答。
[000引另外，相關技術描述了使用博代氏桿菌菌株來誘導針對例如能夠導致人百日咳的 博代氏桿菌的免疫應答的多種類型的疫苗和組合物（W02007104451和W02003102170);然 而運些技術沒能披露在哺乳動物中通過使用本發明的方法、組合物和/或疫苗來誘發針對 流感病毒的免疫應答的方法或組合物。
[0009] 因此，對于能夠廣泛抵抗由流感病毒感染引起的疾病的新型流感疫苗存在需求。
【發明內容】
[0010] 本發明設及組合物和疫苗，其包括用于治療或預防哺乳動物流感病毒感染的突變 的博代氏桿菌菌株。另外，本發明進一步提供了使用該組合物或疫苗來保護哺乳動物免受 流感病毒感染和/或在哺乳動物中誘發針對流感病毒的免疫應答的方法。
[0011] 在一個方面，本發明提供了一種在哺乳動物中誘發針對流感病毒的免疫應答的 方法，包括：對哺乳動物施用突變的博代氏桿菌菌株，其中該菌株包含突變的百日咳毒素 (ptx)基因、缺失或突變的皮膚壞死（化t)基因、和異源ampG基因。在一些方面，該博代氏 桿菌菌株包括百日咳博代氏桿菌菌株。在一些方面，野生型博代氏桿菌ampG基因被替換為 大腸桿菌ampG基因。在其它方面，ptx基因的突變包括對參與底物結合的氨基酸和/或參 與催化的氨基酸進行替換。在一些方面，參與底物結合的氨基酸的替換包括K9R，且參與催 化的氨基酸的替換包括E129G。在一些方面，該博代氏桿菌菌株包括Ξ突變的菌株。在一 些方面，該博代氏桿菌菌株包括BPZE1菌株。在其它方面，該博代氏桿菌菌株是減毒的。在 一些方面，該博代氏桿菌菌株包括活菌株。在其它方面，該博代氏桿菌菌株不包含除了異源 ampG基因W外的其它異源基因。在一些方面，該博代氏桿菌菌株不包含攜帶異源抗原至哺 乳動物呼吸黏膜的異源表達平臺。在其它方面，該方法進一步包括預防或治療哺乳動物流 感病毒感染。在一些方面，該博代氏桿菌菌株在流感病毒感染前給藥。在一些方面，該博代 氏桿菌菌株在流感病毒感染前約6周或更多時間給藥。在其它方面，該博代氏桿菌菌株在 流感病毒感染前約12周或更多時間給藥。在一些方面，該流感病毒包含H3或H1。在其它 方面，該流感病毒包含N2或N1。
[0012] 在一些方面，該流感病毒包含冊和肥。在其它方面，該流感病毒包含化和N1。在 一些方面，免疫應答包括Thl免疫應答。在一些方面，該菌株對哺乳動物通過皮下（S.C.)、 皮內（i.d.)、肌肉內（i.m.)、靜脈內（i.v.)、口服、或鼻內給藥；或通過注射或吸入。在其它 方面，該菌株經鼻內給藥。在一些其它方面，該菌株被給藥至需要針對流感病毒感染的保護 性免疫的哺乳動物。在一些方面該哺乳動物是兒童。在一些方面，該菌株W單一劑量給藥一 次。在一些方面，該菌株給藥多于一次。在一些方面，該菌株W兩個劑量給藥兩次。在其它 方面，該兩個劑量約隔3周給藥。在一些方面，抵抗流感病毒感染的保護水平高于約60%。 在其它方面，抵抗流感病毒感染的保護水平高于約50%。在一些方面，該哺乳動物是人。
[0013] 在另一方面，本發明提供了對人體誘發針對H3N2流感病毒的保護性免疫應答的 方法，包括：在人體感染H3N2流感病毒之前對人體鼻內給藥活體和減毒的BPZE1菌株，其中 該菌株不包含攜帶異源抗原至人體呼吸黏膜的異源表達平臺。
[0014] 在另一方面，本發明提供了在人體誘發針對流感病毒的免疫應答的方法，包括：對 人體給藥活博代氏桿菌菌株，其中該菌株不包含攜帶異源抗原至人體呼吸黏膜的異源表達 平臺。
[0015]在另一方面，本發明提供了保護哺乳動物免受流感病毒感染導致的疾病的方法， 包括：對哺乳動物給藥突變的博代氏桿菌菌株，其包含突變的ptx基因、缺失或突變的化t 基因、和異源ampG基因。
[0016] 在另一方面，本發明提供了一種針對流感病毒感染的保護性免疫，包括：對哺乳 動物給藥突變的博代氏桿菌菌株，其包含突變的ptx基因、缺失或突變的化t基因、和異源 ampG基因。
[0017] 在另一方面，本發明提供了一種用于治療或預防哺乳動物流感病毒感染的組合 物，包括：突變的博代氏桿菌菌株，其中該菌株包含突變的百日咳毒素（Ptx)基因、缺失或 突變的皮膚壞死（化t)基因、和異源ampG基因。在一些方面，該博代氏桿菌菌株包括百日 咳博代氏桿菌菌株。在其它方面，野生型博代氏桿菌菌株的ampG基因被替換為大腸桿菌 ampG基因。在一些方面，ptx基因的突變包括對參與底物結合的氨基酸和/或參與催化的 氨基酸進行的替換。在其它方面，參與底物結合的氨基酸的替換包括K9R，且參與催化的氨 基酸的替換包括E129G。在一些方面，該博代氏桿菌菌株包括Ξ突變的菌株。
[0018] 在一些方面，該博代氏桿菌菌株可包括BPZE1菌株。在一些方面，該博代氏桿菌菌 株可W是減毒的。在一些方面，該博代氏桿菌菌株可包括活菌株。
[0019] 在一些方面，該博代氏桿菌菌株可不包含除異源ampG基因之外的其它異源基因。 在一些方面，該博代氏桿菌菌株可不包含攜帶異源抗原至哺乳動物呼吸黏膜的異源表達平 臺。
[0020] 在一些方面，該組合物還可包括藥學上合適的賦形劑、載體和/或運載體。在一些 方面，該組合物還可包括佐劑。在其它的方面，該組合物還可包括能夠影響流感病毒感染的 小分子。
[0021] 在另一方面，本發明提供了一種疫苗，其包含用于治療或預防哺乳動物流感病毒 感染的本發明的組合物。在一些方面，該疫苗包含在此描述的博代氏桿菌菌株組合物。在 一些方面，該疫苗被配制為用于鼻腔給藥。
[0022] 在另一方面，本發明提供了一種博代氏桿菌菌株，其保藏號為CNCM1-3585。
[0023] 在另一方面，本發明提供了一種博代氏桿菌菌株，其保藏號為V09/009169。
[0024] 在一些方面，本發明提供了一種組合物，其包含保藏號為CNCM1-3585的博代氏桿 菌菌株。另一方面，本發明還提供了一種疫苗，其包含該包含保藏號為CNCM1-3585的博代 氏桿菌菌株的組合物，用于治療或預防哺乳動物流感病毒感染。在一些方面，該疫苗可被配 制為用于鼻腔給藥。
[00巧]在一些方面，本發明提供了一種組合物，其包含保藏號為V09/009169的博代氏桿 菌菌株。另一方面，本發明還提供了一種疫苗，其包含該包含保藏號為V09/009169的博代 氏桿菌菌株的組合物，用于治療或預防哺乳動物流感病毒感染。在一些方面，該疫苗可被配 制為用于鼻腔給藥。
【附圖說明】
[00%] 通過W下描述及附圖可W更好地理解本發明的運些和其它特征、方面和優點，其 中：
[0027] 圖1顯示了用BPZE1處理的小鼠對抗小鼠適應性冊N2病毒的致死性攻擊的保護 率。成年Ba化/c小鼠被經鼻給藥5x106c化的BPZE1細菌，并在3周（實屯、方塊）或6周 (實屯、Ξ角）后用致死劑量（2LD50)的小鼠適應性H3N2病毒進行攻擊。每天監測體重變 化，當小鼠體重損失超過原始體重的20%時對其進行安樂死。將存活率與未經處理的小鼠 (實屯、菱形）進行比較。每組評價10只動物。結果代表Ξ個獨立實驗。
[0028] 圖2顯示了用死BPZE1細菌和活BPZE1細菌處理的小鼠對抗小鼠適應性冊N2病 毒的致死性攻擊的保護率。成年Ba化/c小鼠被經鼻給藥5X106c化的活BPZE1細菌（實 屯、Ξ角）或死（實屯、方塊）BPZE1細菌，并在6周后用致死劑量（2LD50)的小鼠適應性H3N2 病毒進行攻擊。每天監測體重變化，當小鼠體重損失超過原始體重的20%時對其進行安樂 死。將存活率與未經處理的小鼠（實屯、菱形）進行比較。每組評價10只動物。結果代表 二個獨立實驗。
[0029] 圖3顯示了用BPZE1活菌處理兩次的小鼠對抗小鼠適應性冊N2病毒的致死性攻 擊的保護率。成年Ba化/c小鼠在4周的間隔中兩次經鼻給藥5X106c化的BPZEl細菌（實 屯、方塊），并在4周后用致死劑量（2LD50)的小鼠適應性H3N2病毒進行攻擊。每天監測體 重變化，當小鼠體重損失超過原始體重的20%時對其進行安樂死。將存活率與未經處理的 小鼠（實屯、菱形）進行比較。每組評價10只動物。結果代表二個獨立實驗。
[0030] 圖4顯示了用BPZE1處理的小鼠對抗化N1甲型流感病毒的致死性攻擊的保護率。 成年Ba化/c小鼠在4周和3周（實屯、Ξ角）的間隔中Ξ次經鼻給藥5X106c化的BPZE1活 菌。在最后一次BPZE1處理后2周對動物用致死劑量（4LD50)的A/PR/8/34化1N1)甲型流 感病毒進行攻擊。每天監測體重變化，當小鼠體重損失超過原始體重的20%時對其進行安 樂死。將存活率與未經處理的小鼠（實屯、菱形）進行比較。每組評價10只動物。結果代 表二個獨立實驗。
[0031] 圖5顯示了受保護的小鼠肺部和未受保護的小鼠肺部的病毒載量。成年Ba化/c小 鼠在4周的間隔中2次經鼻給藥5X106c化的BPZE1活菌，并在4周后用致死劑量（2LD50) 的小鼠適應性H3N2病毒進行攻擊。病毒攻擊3天后每組殺死五只動物，取其肺部并各自進 行MDCK細胞感染的TCI^。的體外檢測。將病毒載量與未經處理的小鼠進行比較。結果代 表Ξ個獨立實驗。
[0032] 圖6顯示了致死劑量病毒攻擊后BPZE1處理的和未經處理的小鼠肺部中肺組織和 細胞浸潤W及CD3+T細胞群。成年Ba化/c小鼠被經鼻給藥5x106c化的BPZE1活菌，并在6 周后用致死劑量（2LD50)的小鼠適應性H3N2病毒進行攻擊。病毒攻擊3天后，對小鼠進行 安樂死，對其肺部分別進行組織學分析（A)或用于細胞浸潤分析的支氣管肺泡灌洗度）。圖 例A:感染的對照小鼠表現出嚴重發炎、肺水腫（黑色箭頭）和伴有壞死細胞碎片的嚴重壞 死性支氣管炎（空屯、箭頭）。感染的BPZE1處理的小鼠僅表現出最小限度的發炎和呼吸道 受傷，W及輕微的細支氣管周邊損傷。示出了代表性的區域。結果等價于每組分析超過40 個區域（巧區域/截面，2截面/小鼠和4小鼠/組）。圖例B:a，未免疫的（η鞭淮)小鼠 未受攻擊；b，未免疫的小鼠用冊Ν2病毒攻擊；C，ΒΡΖΕ1處理的小鼠未受攻擊；山ΒΡΖΕ1處理 的小鼠用H3N2病毒攻擊。對于每組每個時間點的四只動物進行分別評價。**，p《 0.01; ***，p《0.001。結果代表二個獨立實驗。（C)小鼠肺部的CD3叮細胞群的FACS分析。致 死性H3N2流感病毒攻擊3天或5天后，未處理的對照小鼠和BPZE1處理兩次的小鼠進行安 樂死，通過流式細胞儀分析其肺部的CD3+T細胞群。對于每組每個時間點的四只動物進行 分別評價。結果表示為全肺細胞群中CD3+T細胞的百分比。平均值+SD。圖例：曰，未免疫 的小鼠未受攻擊；b，BPZE1處理的小鼠未受攻擊；C，未免疫的小鼠用H3N2病毒攻擊并在3 天后處死；山BPZE1處理的小鼠用H3N2病毒攻擊并在3天后處死；e，未免疫的小鼠用H3N2 病毒攻擊并在5天后處死；f，BPZE1處理的小鼠用冊N2病毒攻擊并在5天后處死。***， P《0. 001。
[0033] 圖7顯示了BPZE1處理的小鼠和未經處理的小鼠在致死性冊N2病毒攻擊后的 促-和抗-炎性細胞因子和趨化因子譜。成年Ba化/c小鼠在4周的間隔中兩次經鼻給藥 5x106c化的BPZE1活菌并在最后一次給藥的4周后用致死劑量（2LD50)的小鼠適應性H3N2 病毒進行攻擊。病毒攻擊1天和3天后，每組在每個時間點處死5只小鼠并收集支氣管肺泡 灌洗液度ALF)。對于每個BALF樣品檢測14種炎性相關的細胞因子和趨化因子。圖例：1， 未處理的未受攻擊小鼠；2，BPZE1處理的未受攻擊小鼠；3,未處理的受攻擊小鼠且攻擊后1 天處死；4,BPZEl處理的受攻擊小鼠且攻擊后1天處死；5,未處理的受攻擊小鼠且攻擊后3 天處死；6,BPZE1處理的受攻擊小鼠且攻擊后3天處死。*，P《0. 05 ;**，P《0. 01 ;***， P《0. 001。
[0034] 圖8顯示了百日咳博代氏桿菌化pedussis)特異性免疫在交叉保護中的作用。 (A).用小鼠適應性H3N2病毒進行致死性攻擊（2LD50)的一天前將未免疫的血清（空屯、Ξ 角）或抗-冊N2 (實屯、圓）或抗-BPZE1 (空屯、圓）的免疫血清經腹腔（ip.)注射至成年未免 疫的Ba化/c小鼠。每天監測體重變化，當小鼠體重損失超過原始體重的20 %時對其進行安 樂死。將存活率與未經處理的小鼠進行比較（實屯、Ξ角）。每組評價10只動物。度)&似. 成年Ba化/c小鼠被經鼻給藥5x106c化的BPZE1活菌，6周后進行安樂死收集其脾臟。用 BPZE1裂解物或熱失活冊N2病毒顆粒刺激來自6只動物的混合度）或個體（C)脾臟細胞。 按照W下描述進行3H-胸腺喀晚滲入度）和IFN-丫化ISP0T分析（C)。兩組不同實驗的代 表值的結果相似；平均值+SD;*，P《0. 05, ***，P《0. 001。
【具體實施方式】
[0035] 介紹和綜述
[0036] 本發明設及用于在哺乳動物中治療或預防流感病毒感染的組合物和疫苗，它們包 括突變的博代氏桿菌菌株。另外，本發明進一步提供了使用該組合物或疫苗保護哺乳動物 免受流感病毒感染和/或在哺乳動物中誘發針對流感病毒的免疫應答的方法。
[0037] 除非另有說明，否則權利要求書和說明書中的術語按照W下定義。
[0038] 在此使用的縮寫叩TX"指百日咳毒素，其合成并分泌一種ADP-核糖基化毒素。PTX 由五個不同亞基（稱為S1-S5)組成，各復合物含有兩個拷貝的S4。各亞基按照A-B結構排 列。A部分具有酶活性，形成于S1亞基，B部分是受體結合部分，由S2-S5亞基組成。
[0039] 在此使用的縮寫"DNT"指百日咳皮膚壞死毒素，其是一種不耐熱毒素，能夠在皮內 注射時誘導小鼠和其它實驗室動物發生局部損傷。
[0040] 在此使用的縮寫"TCT"指氣管細胞毒素，其是一種博代氏桿菌合成的致病因子。 TCT是一種膚聚糖片段，能夠誘導白介素-1的生產和一氧化氮的合成。其能夠導致纖毛郁 積（stasis)，并對于呼吸道上皮細胞具有致死效果。
[0041] 術語"減毒"指減弱的、低毒性的博代氏桿菌菌株，其能刺激免疫應答和產生保護 性免疫，但一般不會導致生病。
[0042] 術語"快速保護性免疫"指在本發明的突變博代氏桿菌菌株給藥后短時間內具有 針對博代氏桿菌的免疫。
[0043] 術語"博代氏桿菌菌株"或"菌株"包括來自百日咳博代氏桿菌度ordetella pertussis)、副百日咳博代氏桿菌度ordetellaparapertussis)和支氣管炎博代氏桿菌 (Bordetellabronchiseptica)的菌株。 W44] 術語"兒童"指0月到18歲大的人或哺乳動物。
[0045]"治療"指對疾病、病癥或素亂進行成功處理或改善或預防的任何指標，包括任何 客觀或主觀參數，例如，減輕；緩解；癥狀消失或使得疾病癥狀對病人而言更易忍受；減緩 退化或衰弱的速度；或使惡化末期沒那么衰弱。癥狀的治療或減緩可W基于客觀或主觀參 數；包括醫師的檢查。從而，術語"治療"包括施用本發明的化合物或試劑W預防或延遲、減 緩或阻止或抑制與在此描述的疾病、病癥或素亂有關的病情的發展。術語"治療效果"指在 受試者中疾病、病癥或副反應的減少、消除或預防。使用本發明的方法進行"治療"或"處 理"包括預防可能導致與在此描述的疾病、病癥或素亂有關的疾病或素亂的風險增加、但是 還沒有發生或表現出病情的癥狀在受試者中發作；抑制疾病或素亂的癥狀（減緩或阻止其 發展）；減輕疾病的癥狀或副反應（包括舒減療法）；和減輕（導致退化的）疾病癥狀。治 療可W是預防性的（預防或延遲疾病發作，或防止其臨床或亞臨床癥狀）或在疾病或病況 表現之后治療抑制或減輕癥狀。
[0046] 將本發明的組合物與已知藥物（或其它化合物）進行"聯合用藥"指在一定時候將 組合物與該藥物（或其它化合物）一同給藥，從而二者都具有治療或診斷效果。運種聯合 用藥可W包括相對于施用本發明的組合物而言對該藥物（或其它化合物）進行并行（即， 同時）、在前或相繼給藥。本領域一般技術人員將能夠很容易判斷特定藥物（或其它化合 物）W及本發明的組合物的合適的給藥時間、順序和劑量。
[0047] 在此使用的術語"保護"和"預防"可交換使用，意為阻止流感病毒感染。
[0048]"預防性疫苗"指該疫苗預防未來暴露在流感病毒后感染。
[0049] 術語"免疫原性組合物"或"組合物"指能夠誘導免疫應答并從而具有抗原性的組 合物。"免疫應答"指免疫系統的任何反應。運些反應包括有機體的免疫系統針對抗原的活 性變化，其可W包括，例如，抗體生產、誘導細胞介導的免疫、補體激活、或免疫耐受的形成。
[0050] 在此使用的術語"疾病"具有本領域一般公知的和理解的含義，包括宿主個體的功 能或健康的任何非正常狀況。醫療保健人員對特定疾病的診斷可W通過直接檢查和/或對 一種或多種診斷檢測的結果進行分析來得出。
[0051] 術語"活疫苗組合物"、"活疫苗"、"活細菌疫苗"、W及相似術語表示一種組合物， 其含括提供至少部分針對流感的保護性免疫的活博代氏桿菌。 陽〇巧術語"口服"、"腸內"、"經腸"、"經口V'非-腸道外"、"非-不經腸道"等等，表示 經由消化道的途徑或方式將化合物或組合物給藥至個體。組合物經"口服"途徑給藥的例 子包括但不限于，經口腔吞咽液體或固體形式的疫苗組合物、經鼻空腸或胃造口管的疫苗 組合物給藥、疫苗組合物的十二指腸給藥、和直腸給藥，例如，使用釋放在此描述的活菌疫 苗菌株的栓劑。
[0053] 術語"局部用藥"指對皮膚或黏膜的外表面（包括鼻、肺和嘴的外表面）施用藥物 試劑，從而該藥劑穿過皮膚或黏膜的外表面并進入在下的組織。局部用藥會導致藥劑在皮 膚和周圍組織的有限分配，或者，當藥劑隨血液流動從治療區移走后，會導致藥劑的全身性 分配。在優選的形式中，藥劑通過經皮給藥進行遞送，例如，使用皮膚藥貼。經皮給藥指藥 劑穿過皮膚（角質層和上皮層）進行擴散，皮膚表現為一種使得很少藥劑能夠穿透的障礙 存在。相反，真皮是可滲透的，能夠吸收多種溶解物和藥物，從而局部用藥更容易透過被擦 傷或W其它方式剝落表皮露出真皮的皮膚。經完整皮膚的吸收可W通過在皮膚用藥（涂擦 過程）之前進行活性藥劑和油性載體的結合來獲得增強（例如，霜劑，潤滑劑，穿透促進劑 等等，描述于例如，Remington'SPharmaceuticalSciences,現行版，Gennaro等人編輯）。
[0054] 術語"鼻腔給藥"指對受試者的鼻腔通道推入或W其它方式引入活性成分、從而其 接觸鼻腔呼吸上皮并從該處吸收至全身循環的任何形式的給藥。鼻腔給藥也可包括接觸位 于鼻腔頂部鼻中隔和各主要鼻通道側壁之間的嗅覺上皮細胞。直接圍繞嗅覺上皮的鼻腔區 域不接觸氣流。從而，一般需要采用特殊方法來達到透過嗅覺上皮的顯著吸收。
[0055] 術語"氣霧劑"按其常規含義使用，指非常精細的液體或固體顆粒在