生物硅在制備BMP-2/Smad/RUNX2信號通路激活劑中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種生物娃在制備BMP-2/Smad/RUNX2信號通路激活劑中的應用，屬 于生物醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松是W骨量減少、骨的微觀結構退化為特征的，致使骨的脆性增加W及易 于發生骨折的全身性骨骼疾病。2006年我國統計顯示，60歲W上的老年人骨質疏松發病率 為59. 85%，超過9000萬人。因骨質疏松而發生骨折的發病率達20%，并且骨折具有"四高 一低"的特點，即高發病率、高死亡率、高致殘率、高費用和低生活質量，給病人家庭和社會 帶來沉重的負擔，嚴重威脅著老年人的生活質量。在英國，因骨質疏松所花費的醫保費用已 達到10億多英鎊。
[0003] 骨質疏松的發病原因是多方面的，遺傳和激素是引起骨量下降的兩大主要因素， 同時年齡增長、營養缺乏、吸煙、醒酒W及缺乏體育鍛煉也是引起骨質疏松的因素。盡管理 論上可W改變運些非遺傳因素，但是實際上運些改變是很困難的，因此抗骨質疏松的藥物 被廣泛應用。骨質疏松是破骨細胞的骨吸收作用大于成骨細胞的骨形成作用而引起的。目 前已開發出W抑制骨吸收為目的的治療骨質疏松藥物，如二憐酸鹽，雌激素，雌激素受體調 節劑等；但是很少有增加成骨細胞從而促進骨形成的藥物的報道（重組人甲狀旁腺素，鎖 W及氣化鋼除外）。
[0004] 成骨細胞分化是受到體內外多種因素作用的結果，其中，控制分化的關鍵轉錄因 子起到決定或維持作用。研究表明，骨形態形成蛋白-2度onemo;rphogeneticp;rotein-2， BMP-2)能夠促進非成骨細胞的成骨作用，被認為是骨形成的促進劑。目前已篩選到 statins運類小分子來誘導BMP的表達從而增強骨形成（Mundyetal.，1999)，但目前臨床 上用于促進BMP的表達的藥物還相對較少，因此，進一步開發具有BMP-2促進作用的藥物具 有十分重要的臨床應用價值。
[0005] 娃在自然界中W不可溶性的娃酸鹽廣泛存在，但是少量的娃也存在于水中，主要 W原娃酸（Si(0H)4)的形式溶于水。在PH值為7左右，濃度大于2mmol/L時，原娃酸從可溶 性的二聚體聚合形成膠體狀甚至固體狀的娃。一些植物和低等動物由于需要運種聚合娃來 支撐和生長，因此它們可促進運一變化。人正常飲食中的娃主要來源于W下途徑：消化道吸 收的水溶性的或食物水解產生的原娃酸；植物中含有的非水解聚合娃；泥沙或塵±污染W 及食品添加劑中的娃酸鹽。但是只有原娃酸可W被吸收，并且其吸收效率超過50%。人體血 液中娃濃度在餐前為2-10μM，餐后達到20-30μM，并且每天通過尿液排出大約700μmol。
[0006] 盡管其在體內的含量只有l-2g，并且具體功能也不十分清楚，但娃是影響骨量的 重要微量元素之一，因此，進一步研究娃在成骨細胞分化中的所起的作用具有十分重要的 研究價值。
【發明內容】
[0007] 針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種生物娃在制備BMP-2/Smad/RUNX2 信號通路激活劑中的應用。
[0008] 本發明首次通過實驗證實：一定濃度的生物娃可W作為BMP-2表達的促進劑。
[0009] 進一步的，本發明首次發現：生物娃通過BMP-2/Smad/RUNX2信號通路起到調控成 骨細胞合成骨膠原蛋白的作用。
[0010] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0011] 本發明的第一個目的是提供生物娃在制備促進BMP-2表達的促進劑中的應用。
[0012] 上述應用中，所述生物娃的濃度為10-20μM，優選為10μM。
[0013] 上述應用中，所述生物娃優選為原娃酸。
[0014] 本發明的第二個目的是提供生物娃在制備BMP-2/Smad/RUNX2信號通路激活劑中 的應用。
[0015] 進一步的，上述生物娃在制備促進成骨細胞合成骨膠原蛋白的藥物中的應用也是 本發明的保護范圍。
[0016] 上述應用中，生物娃的濃度優選為10μM。
[0017] 本發明的有益效果：
[0018] (1)本發明經實驗證實：一定濃度的生物娃可W顯著增加ΒΜΡ-2的表達；ΒΜΡ-2 是BMP-2/Smad/RUNX2信號通路的關鍵受體，ΒΜΡ-2的高表達可W通過Smad信號通路上調 RUNX2的表達，RUNX2在成骨細胞系中的高表達，促進了成骨細胞合成骨膠原蛋白，在相應 藥物開發中具有極大的應用價值。
[0019] (2)生物娃的濃度是促進BMP-2的表達及調控BMP-2/Smad/RUNX2信號通路的關鍵 因素，生物娃的濃度并非越高越好，在實驗過程中發現，高濃度的生物娃反而會抑制BMP-2 的表達。本發明中經過多次實驗找出了能夠促進BMP-2的表達及作為BMP-2/Smad/RUNX2 信號通路促進劑最優的生物娃濃度（10μΜ)，該濃度下的生物娃對BMP-2表達的促進作用 最為顯著。
【附圖說明】
[0020] 圖1:Westernblotting法檢測MG-63和U2-0S細胞系中I型膠原蛋白 (COkl)、骨巧素、BMP-2、Smadl/5、P-Smadl/5及RUNX2蛋白表達水平結果；兩個細胞系中 BMP-2,P-Smadl/5,RUNX2,C0L-1和骨巧素的表達比對照組明顯增加。
[0021] 圖2 :MG-63細胞堿性憐酸酶（AL巧活性檢測結果；在四組不同娃濃度條件下作用 7天，10μΜ和20μΜ條件下，堿性憐酸酶濃度均高于對照組，其中10μΜ時最明顯。
[002引圖3 :細胞免疫巧光法檢測加入娃（10μΜ)后ΒΜΡ-2、P-Smadl/5及RUNX2的變化 情況。實驗組巧光強度較對照組明顯增強。
[0023] 圖4 :大鼠骨髓間充質干細胞經過21天的誘導，巧結節染色情況；10μΜ濃度下較 對照巧結節數量明顯增多。
[0024] 圖5:預先加入ΒΜΡ-2受體阻斷劑noggin巧OOng/ml)作用化，再加入原娃酸濃度 為10μΜ的培養基，兩個細胞系的中I型膠原蛋白佑化-1)、Smadl/5、P-Smadl/5及RUNX2 蛋白表達水平。
【具體實施方式】
[0025] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[0026] 實施例1 :
[0027] 1.實驗材料；
[002引 （1)細胞：
[0029] 人成骨樣細胞：MG-63和U2-0S細胞系；
[0030] 大鼠骨髓間充質干細胞。
[0031]W上細胞均購自上海齊氏生物科技有限公司。
[0032] 似堿性憐酸酶檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。
[0033] (3)細胞免疫巧光法檢測試劑：
[0034] 細胞：MG-63 ;
[0035] 一抗：Anti-BMP-2antibody(購自美國Abeam公司）、Anti-P-Smadl/5/antibody (購自美國〔6115;[即曰1;[]1邑(〔51')公司）、4]11:;[-抓版2曰]11:比〇(17(購自美國413。曰1]1公司）；
[0036] 巧光二抗：GoatAnti-RabbitIgGH&L(Alexa口uor貨488)購自美國Abeam公司；
[0037] DAPI溶