熒光固體脂質納米顆粒組合物及其制備
【專利說明】熒光固體脂質納米顆粒組合物及其制備
[0001] 本發明涉及藥學和診斷組合物領域，特別涉及包含熒光探針的組合物，更特別涉 及包含所述探針的固體脂質納米顆粒。
[0002] 本發明還涉及儀器診斷學，特別是實時成像引導手術的領域。
[0003] 發明背景
[0004] 吲哚菁綠（本文中也稱為ICG)是經FDA批準的熒光探針，但是遭受快的代謝清 除，因為其通過肝臟快速排除。已知的是在靜脈內注射之后，ICG結合至白蛋白并且隨后 幾乎僅被肝實質細胞攝取。當以〇. 5mg/kg的人推薦劑量施用ICG時，正常的血液半衰期 為大約 3.0 分鐘（RosenthalE，ZinnKR編輯，OpticalImagingofCancer:Clinical Applications.NewYork,NY,USA:Springer;2009 年，第 72 頁）。該有效的肝膽排泄防止了 ICG在特定病理部位的選擇性積累，限制了其可能的臨床應用，所述應用實際上主要被局限 于在眼部血管造影術，肝功能表征，或心輸出量的測量方面的應用的血流的光學檢查。
[0005] 吲哚菁綠被認為是在臨床上熒光成像應用方面高靈敏度腫瘤檢測和淋巴結的顯 像的有希望的候選物。尤其希望的是在手術切除病灶或內窺鏡手術治療期間用于癌的病灶 和前哨淋巴結檢測的實時可視化的ICG的制劑。
[0006] 然而，如以上所述，由于其在人血液中的非常低的停留時間，當以0. 5mg/kg的臨 床推薦劑量使用時，ICG在靜脈內施用之后不具有在腫瘤組織處的任何明顯靶向性質。
[0007] 此外，ICG在水溶液中不穩定（已經在μΜ濃度），并且由于其聚集傾向而必 須在6小時內使用。染料-染料相互作用隨著消光系數的降低和染料激發后的熒光 自猝滅效應而對ICG的光學性質有不良影響（Landsman，M.L. ;Kwant，G. ;Mook，G.Α.; Zijlstra,ff.G.Lightabsorbingproperties,stability,andspectralstabilization ofindocyaninegreen.J.Appl.Physiol. 1976, 40, 575 - 83).
[0008]SaxenaV.等人（JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology 74 (2004) 29-39)公開了用于改進ICG的水穩定性、光穩定性和熱穩定性的聚（DL-乳酸共乙 醇酸）和聚乙烯醇聚合物型納米顆粒。在該工作中，即使負載ICG的納米顆粒的穩定性由 于將ICG包埋于聚合物包囊中而得以改進（在水溶液中顯示2. 5-3天的半衰期），但是呈納 米顆粒的ICG就游離的ICG溶液而言仍顯示出在其峰值熒光強度方面的降低。該發現連同 高粒度分布（平均直徑約350nm)可能導致在腫瘤靶向的體內成像方面的低效率。
[0009] W02010/018216公開了ICG吲哚菁綠的熒光納米乳液，其在油相ICG中包含至少一 種兩親性脂質和至少一種在25°C為固體的增溶性脂質。根據該文獻，納米乳液中的液滴應 當具有無定型核芯，因為結晶性被認為對有利于將經包封的分子排出至液滴或它們的聚集 體外部的納米乳液穩定性不利。
[0010] 盡管通過上述納米顆粒和納米乳液提供了明顯的進步，但將ICG用于近紅外成像 仍遇到問題。Altino含III和Adair(WIREsNanomedicineandNanobiotechnology，第二卷， 2010年九月/十月，461-477)證實了量子點（QD)在NIR成像中優異的光學和穩定性性質。 然而，毒性問題阻礙了它們的使用并且仍建議NIR染料。回顧了ICG在由磷酸鈣合成的納 米顆粒中的包封，并且盡管相對于QD的性能較低，但仍建議其臨床應用。
[0011]Zheng等人（Mol.Pharmaceutics2011，8, 447-456)，為 了克服ICG的差的水穩 定性、其非特異性結合至蛋白質和缺乏靶向特異性的問題，公開了利用磷脂-聚乙二醇 (PL-PEG)與ICG之間的非共價自組裝化學的含ICG的納米結構。建議了該納米結構用于靶 向光學成像和光熱治療的雙重功能。最近已描述了它們在體內光熱治療中的用途（Zheng 等人，Mol.Pharm, 2012, 9 (3) : 514-522) ·
[0012] Navarro等人（JournalofBiomedicalNanotechnology，第 8 卷，594-604 和 730-741,2012)公開了有利于術中熒光的ICG的脂質納米顆粒向量化（LNP)。在所述工作 中，在至多兩天量化了ICG-LNP與游離染料注射相比的體內腫瘤/皮膚和體外腫瘤/肌肉 熒光比例的改進（在24和48h之間為2倍）。
[0013]US2006/0083781公開了固體脂質納米顆粒，其考慮到它們在腫瘤靶向治療系統， 溫敏凈荷遞送系統，磁驅動靶向系統，治療診斷系統，穩定化的油墨組合物和化妝品制劑中 的應用而被官能化。此外，可修改所開發的方法以包封脂質環境中的量子點，減少它們對氧 化性物質的可接近性和與Cd相關的毒性。
[0014]Sawant和Dodiya(RecentPatentsonDrugDelivery&Formulati on2008, 2, 120-135)中提供了對待用于脂質納米顆粒制備的所有方法的現有技術的 回顧。為了使納米顆粒的遞送性質最優化，優選需要低于l〇〇nm的粒度。相反地，文 獻中所開發的許多方法為SLN提供了微米范圍（Cortesi等人，Biomaterials2002; 23:2283-2294)或不低于 200nm(Garcia-Fuentes等人，ColloidsandSurfaces B:Biointerfaces, 2003, 27:159-168;Morel等人，EuropeanJournalofPharmaceutics andBiopharmaceutics45(1998) 157 - 163)的平均粒度，即遠高于優選的納米尺度范圍。
[0015] 有利地，在本發明中，納米懸浮液的制劑顯示出低于100nm的粒度且顯示出延長 的血液循環半衰期和改進的光穩定性和熒光信號。
[0016] 這些不可預料的結果通過最優化兩親性組分和制備方法而得以實現。
[0017] 發明簡述
[0018] 現已不可預料地發現，將ICG以及ICG的其它熒光染料類似物連同其它化學結構 引入固體脂質納米顆粒，解決了現有技術的上述問題，還提供了另外的有利之處，其將由本 發明的以下公開而明白可見。
[0019] 本發明的一個目的是固體脂質納米顆粒（下文也稱為SLN或簡稱為納米顆粒），其 包括：
[0020] a.固體脂質核芯，其包括至少一種甘油酯和/或至少一種脂肪酸；
[0021] b.兩親性組分的混合物；
[0022] c.以具有式I和/或II的化合物的堿土金屬配合物存在的兩親性組分：
[0023]
[0024] 其中，基團將在以下說明書中定義。
[0025]d.菁家族的焚光染料和/或多雜環化合物（polyetherocycliccompound)，包括 香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其藥學上可 接受的鹽。
[0026] 本發明的另一目的是用于制備所述納米顆粒的方法。
[0027] 本發明的另一目的是藥物組合物，其包含上述納米顆粒，尤其是用于診斷。
[0028] 本發明的另一目的是上述納米顆粒，其用作診斷劑。
[0029] 本發明的另一目的是上述納米顆粒，其中分子靶向結構部分存在于納米顆粒表面 上，實現了對所選擇的靶器官、組織或細胞的相關結合親和力。
[0030] 本發明的另一目的是上述納米顆粒，其作為診斷劑用于儀器診斷學中，尤其是實 時圖像引導手術中。
[0031] 本發明的另一目的是上述納米顆粒，其作為診斷劑用于臨床熒光成像應用中的腫 瘤檢測和淋巴結的顯像，尤其是在手術切除病灶或內窺鏡/腹腔鏡手術治療期間用于癌的 病灶和前哨淋巴結檢測的實時可視化。
[0032]當用熒光染料負載時，本發明的SLN隨著在感興趣的病理性組織中隨后的聚集由 于增強的滲透和保留（EPR)效應而允許延長的血液循環半衰期。
[0033] 根據本發明的SLN由于關于熒光團的游離形式的脂質基質保護效應和改進的熒 光信號而顯示出增強的光穩定性。
[0034] 此外，脂質組分可以防止染料受取決于與猝滅劑分子的相互作用的降解因素或受 由于臨界生物條件（即酸性pH)的化學降解或受光暴露（光致褪色過程）的損害。
[0035] 最后，將熒光染料配制到根據本發明的SLN中由于由周圍組分的空間約束產生的 非輻射馳豫速率的降低而改進了染料的熒光量子產率（Φ)。
[0036] 這些和其它目的以及有利之處將在以下說明書中還借助附圖和實施例詳細公開。
【附圖說明】
[0037] 圖1展現了本發明的負載ICG的SLN的典型粒度分布。
[0038] 圖2展現了ICG和負載ICG的SLN的光致褪色試驗結果。
[0039] 圖3展現了負載ICG的SLN的長期穩定性。
[0040] 在圖4中，畫面A展現了負載ICG的SLN在水溶液中于時間點為零（虛線）和在 配制120天之后（黑線）的UV-Vis光譜；畫面B顯示了ICG在水溶液中在不同時間點（時 間點為零：虛線；9天：灰色線；15天：黑線）的UV-Vis光譜。
[0041] 圖5展現了用于評價對負載FA-ICG的SLN(靶向的ICG-SLN)的和非靶向 SLN(ICG-SLN)的抗葉酸IgG的結合親和力的激光干涉法試驗。
[0042] 圖6展現了在帶有IGR0V-1異種移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用負載 ICG的SLN和負載FA-ICG的SLN之后24h的小鼠（η= 6)的體外分析。
[0043] 圖7展現了在帶有IGR0V-1異種移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用 ICG-SLN(畫面A)和FA-ICG-SLN(畫面B)之后24h的兩代表性小鼠的體外分析。
[0044] 圖8展現了靶向的負載ICG的SLN的光密度（750nm)。
[0045] 圖9展現了實施例1的負載ICG的SLN的DSC。
[0046] 圖10顯示了實施例2的負載ICG的SLN的DSC曲線。
[0047] 發明詳述
[0048] 根據本發明的納米顆粒包括以下作為基本組分：
[0049]a)固體脂質核芯，其包括至少一種甘油酯和/或至少一種脂肪酸；
[0050]b)形成圍繞所述核芯a)的殼的兩親性組分的混合物；
[0051] c)以具有式I和/或II的化合物的堿土金屬配合物存在的兩親性組分：
[0052]
[0053] 其中基團如下文所定義，或其藥學上可接受的鹽；
[0054]d)菁家族和/或多雜環化合物的熒光染料，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹 啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其藥學上可接受的鹽。
[0055] 在本發明的另一實施方案中，所述納米顆粒還包括：
[0056]e)具有掩蔽劑（stealthagent)功能的共價連接至所述殼b)的親水性聚合物。
[0057] 在本發明的另一實施方案中，所述納米顆粒還包括：
[0058]f)分子靶向結構部分，用于特異性結合至一個病理學相關的生物學標記物，所述 結構部分連接至所述殼b)或所述親水性聚合物e)。
[0059] 以下百分比組成涉及用于制備SLN的組分a)至f)的量而不考慮最終懸浮液基本 上不含的離子型表面活性劑和低分子量醇的貢獻。
[0060] 在下文，組分a)至f)的每一個表示為相對于SLN干組分總重的量的重量/重 量％。
[0061] 固體脂質核芯a)包括至少一種甘油酯，優選甘油三酯和/或至少一種脂肪酸或 其酯，或其混合物，其至少在室溫（即約20-25Γ)至體溫（37°C)的溫度范圍內為固體形 式。在本發明的第一實施方案中，所述固體脂質核芯a)包括至少一種甘油酯，其選自甘油 單酯、甘油二酯或甘油三酯，具有飽和或不飽和的直鏈或支鏈C12-C24酰基鏈。在甘油二酯和 甘油三酯的情況下，所述酰基鏈可以相同或不同。所述脂肪酸或其酯具有飽和或不飽和的 直鏈或支鏈C12-C24碳鏈。出于本發明的目的還提供所述脂肪酸的酯，優選提供具有C 12-C24 脂肪醇的酯。
[0062] 出于本發明的目的，"固體脂質核芯"意指在室溫（即約20-25Γ)至體溫（即，約 37°C)的溫度為固體的脂質核芯。
[0063] 可以占約30-50% (重量/重量），優選35-45%的所述固體核芯（本文中也稱 為"脂質組分"）包括至少一種甘油酯（選自甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯，具有長度為 12-24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴鏈，具有大于37°C的熔化溫度）或其混合 物和/或至少一種飽和或不飽和的直鏈或支鏈C12-C24脂肪酸或其酯，條件是所選擇的比例 在上述條件下提供固體組合物。
[0064] 所述脂質組分還可以為甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的混合物，例如以名稱 SOFTISAN?和Witepsol?，優選Witepsol?W35、H42、E76、E85 或SOFTISAN? 138、142、154已知的市售混合物。
[0065] 優選地，所述脂質組分由甘油三酯如三棕櫚酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸 甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三花生酸甘油酯或其混合物組成。根據特別 優選的實施方案，所述固體核芯包括三棕櫚酸甘油酯（三棕櫚精，tripalmitin)。
[0066] 所述脂質組分優選包括至少一種C12_C24脂肪酸，其烴鏈可以是飽和或不飽和的、 直鏈或支鏈的。優選地，所述脂肪酸選自：肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山崳酸或其混合物。 所述核芯任選地包括(：12-(：24脂肪酸與c12-c24脂肪醇的單酯或二酯。脂肪酸酯組分可以進 一步例如通過鯨蠟基棕櫚酸酯代表。
[0067] 優選的脂質組合是三棕櫚精和硬脂酸。
[0068] 根據可選的實施方案，a)中的脂質組分可以包括在水中不溶但是在有機溶劑中可 溶的其它脂質。例如，所述脂質可以為酯化的聚（丙烯酸）或酯化的聚（乙烯醇）。尤其 是所述脂質可以為被一種或多種醇全部或部分酯化的聚（丙烯酸）。在一個方面，使少于 全部的丙烯酸殘基酯化。在另一方面，將基本上全部丙烯酸殘基酯化。所述聚合物可以為 均聚物或共聚物。在一個方面，所述脂質可以包含至少一種(： 4_(：24醇。在一個方面，所述醇 可以是飽和或不飽和的，可以是直鏈或支鏈的，且可以是未取代或取代的。每個丙烯酸殘基 處的醇可以相同或可以不同。在另一實施方案中，所述脂質可以為用一種或多種羧酸全部 或部分酯化的聚（乙烯醇）。在一個方面，使少于全部的或基本上全部的乙烯醇殘基酯化。 所述聚合物可以是均聚物或共聚物。在各乙烯醇殘基處的羧酸可以相同或不同。
[0069] 在SLN中，所述脂質組分為固體和呈無定形或晶體形式。
[0070] 根據特別優選的實施方案，所述固體核芯包括三棕櫚精和硬脂酸且為晶體。
[0071] 關于組分b)，本發明包括使用兩親性化合物作為