用于治療視網膜退行性疾病的組合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的引用
[0002] 要求于2013年5月30日提交的美國臨時專利申請號61/828, 701的權益；其內容 以其整體通過引用結合于此。
技術領域
[0003] 本發明涉及用于在視網膜退行性疾病、如年齡相關的黃斑變性的治療中使用的組 合物。所描述的組合物包含用于激活診斷患有該種疾病的受試者的視網膜色素上皮細胞中 的P38和/或JNK信號（信號轉導，signaling)的藥劑。還提供了使用所描述的組合物治 療視網膜退行性疾病的方法。
【背景技術】
[0004] 年齡相關的黃斑變性（AMD)仍然是工業化國家中失明的主要原因（1)。AMD的發 生率隨年齡增加，影響2 %的年齡在50歲的人口以及25 %的年齡在80歲的人口；并影響多 達150萬的美國人以及世界范圍內數百萬人。AMD有兩種形式："干性的"和"濕性的"。干 性AMD影響85-90%的患有AMD的人，并且是一種慢性、無癥狀的疾病，其在早期階段可以導 致一些程度的視覺損害，并可以在疾病晚期進展到法定盲。在干性AMD的早期階段，稱為玻 璃膜疣的不溶性細胞外聚集體在視網膜中積累并與視覺降低相關聯（1)。干性AMD的晚期， 也稱為地圖狀萎縮（GA)，其特征在于退行性的視網膜色素上皮（RPE)細胞的分散的或匯合 的區域以及覆蓋性的視網膜感光細胞，其依賴于RPE用于營養支持。
[0005] 濕性AMD只影響10% -15%的AMD患者，呈現會突然且迅速地進展至失明。濕性 AMD的晚期階段的特征在于脈絡膜新生血管化（CNV)，其中新生脈絡膜血管從脈絡膜朝向 視網膜外層顯露出來。由于濕性AMD的主要病理學是新血管的形成，已建議用抗血管生成 藥物治療受影響的患者來減小失明的風險。因此，通常開具抗血管生成藥如貝伐珠單抗、雷 珠單抗的處方以治療濕性AMD，并且其已經證明使視力退化停止并有益于許多濕性AMD患 者。
[0006] 在干性AMD的早期和晚期形式中，對生長因子和微環境介導的病理變化知道的較 少。在2001年，年齡相關的眼部疾病研究表明日常高劑量抗氧化劑β-胡蘿卜素、維生素 C和Ε、鋅和銅降低了患有中間形式的干性AMD的患者從早期進展到晚期AMD的風險（2)。 建議用于干性AMD的其他治療策略包括視覺周期的調節。通過破壞視黃醇至視紫紅質的轉 換，光轉導的關鍵代謝，在RPE中減少了毒性廢物如脂褐質和A2E(3)。為此建議的治療包括 ACU-4429和芬維A胺。芬維A胺是合成的類視黃醇衍生物，在循環中通過結合視黃醇結合 蛋白與視黃醇競爭。得到的復合物足夠小以通過腎臟排泄，從而減少視黃醇用于在RPE吸 收的可用的池。另外，國際專利公開號W0 2006/127945公開了顯示減少A2E形成的化合物 和組合物。這些化合物被設計以通過減少可用于在光感受器外段中與PE反應（其是A2E 的生物合成途徑中的第一步）的游離RAL的量來抑制A2E生物合成。
[0007] 已建議治療黃斑變性的其他方法，包括使用神經營養受體激動劑、抗炎化合物包 括補體級聯抑制劑、抗細胞凋亡的化合物、類固醇和抗氧化劑化合物（1)。然而，這些與其他 描述的治療沒有解決與該疾病最密切相關的RPE細胞的病理性細胞變性和衰老。因此，存 在對治療AMD的持續需要，并且其潛在地可以有效用于其他視網膜退行性疾病。
【發明內容】
[0008] 本文提供的是這樣的藥物組合物，其包含治療有效量的藥劑，該藥劑激活在受試 者中的視網膜色素上皮（RPE)細胞中的轉化生長因子β激活激酶1(TAK1)和P38或JNK 信號通路中的至少一種，其中該組合物可以用于在受試者中治療視網膜退行性疾病。示例 性組合物包含治療有效量的茴香霉素或其功能性衍生物。
[0009] 還提供了通過給予受試者治療有效量的藥劑，如茴香霉素、TAK1結合蛋白或其功 能性衍生物來治療受試者中的視網膜退行性疾病，該藥劑激活在受試者中的視網膜色素上 皮（RPE)細胞中的TAK1、p38或JNK信號通路中的至少一種。
[0010] 從下面的詳細描述，其參考所附附圖而進行，前述和其他的目的、特征和優點將變 得更加明顯。
【附圖說明】
[0011] 圖1示出TAK1在RPE細胞中參與細胞凋亡和G0/G1細胞周期阻滯。圖1A是來自 RPE細胞的雙染色（膜聯蛋白和碘化丙啶（PI))試驗的FACS分析的繪圖結果，該RPE細胞 是未處理的（左）、用H202處理的（中）或用H202與TAK1抑制劑5Z-7-〇xozeaenol處理的 (右）。圖1B示出如圖A中描述的用TAK1抑制劑、在有或沒有H202的情況下預處理的RPE 細胞的FACS分析。通過其DNA含量（FL2A)測定處于每種細胞周期階段（G1/G0、S和G2/ M)中的細胞百分比，如反映在X軸上的。圖1C以表格形式呈現圖1B中的FACS分析結果。 圖1D是說明比較用TAK1抑制劑5Z-7-〇xozeaenol(1μM)預處理的或未處理的1小時的 ARPE-19細胞的生活力的ΧΤΤ試驗的結果的圖。
[0012] 圖2示出ΤΑΚ1抑制增加經受氧化應激的RPE細胞中SA-β-gal(衰老標志物）的 表達。圖2A是顯示在指定時間用TAK1抑制劑5Z-7-〇xozeaenol處理或未處理的RPE細胞 的SA-β-gal染色的代表性照片。圖2B是表示在指定天數、在用抑制劑處理或未處理的 細胞中SA-β-gal染色呈陽性的細胞的相對量細胞/視野）的直方圖。圖2C是顯示 在用TAK1抑制劑處理1小時然后用200μΜΗ202處理1小時或僅用H202處理的RPE細胞 中的SA-β-gal染色的代表性照片。圖2D是顯示僅用H202或用H202結合TAK1抑制劑的 SA-β-gal染色呈陽性的細胞的相對量（％細胞/視野）的直方圖。
[0013] 圖3顯示在氧化應激期間，TAK1抑制影響p53表達。圖3A顯示用TAK1抑制劑 5Z-7_oxozeaenol(lμM)處理或未處理1小時的RPE細胞的蛋白質印跡（Westernblot) 分析。用指定抗體分析分離的總蛋白提取物，并歸一化至GAPDH。圖3B為代表歸一化至p38 的磷-p38 (ph〇sph〇-p38)水平的圖。圖3C示出RPE細胞的蛋白質印跡分析，該RPE細胞是 未經處理的、用H202處理的、或用TAK1抑制劑5Z-7-〇xozeaenol(lμM)處理并且然后用 Η202處理、并生長至指定天數的。圖3D是代表圖3C的蛋白質印跡結果的直方圖。ρ53水平 被歸一化至GAPDH(結果為2次獨立實驗的平均值）。
[0014] 圖4示出在氧化應激后的TAK1調節。所顯示的是三個獨立實驗的代表性的照片， 其中RPE細胞是用Η202(200μM，1小時）處理的或保持未處理的。然后將細胞用TAK1抗 體（綠色）、肌動蛋白（紅色）和DAPI(藍色）免疫染色。
[0015] 圖5表示顯示TAK1抑制有助于RPE細胞的SASP(導致肥大和功能病癥）的照片。 RPE細胞與TAK1抑制劑和/或H202(200mM) -起生長或不處理生長。2周后，離心來自不同 處理地細胞的條件培養基（conditionedmedia)，并將上清液應用在新的新鮮細胞上。示出 用指定的條件培養基處理72小時的新鮮RPE細胞的代表性照片。比例尺=50μm。
[0016] 圖6示出氧化應激和TAK1抑制增加RPE細胞中的細胞尺寸和SA-β-gal表達。圖 6A示出以下條件的代表性照片（從左到右）：未處理的RPE細胞、對于SA-i3-gal染色大部 分呈陰性、具有正常形態；用氧化應激處理、有或沒有TAK1抑制（5Z-7oxozeanol)的RPE細 胞、用SA-i3-gal染色RPE細胞陽性，具有肥大、平扁和異常形狀的RPE細胞。圖6B示出利 用Image軟件的不同細胞尺寸的量化。對于每處理組，N= 40個細胞。
[0017] 圖7示出用茴香霉素處理減少RPE細胞中（衰老標志物）的出現。將REP細胞用 200mMH202處理1小時或保持未處理10天。在處理（氧化應激）后，將細胞用或不用茴香 霉素10ng/ml處理5min。然后洗滌細胞并生長5天以上。代表性照片顯示對照RPE細胞、 或者用有或沒有茴香霉素氧化應激處理的SA-β-gal染色。
[0018] 圖8說明在低濃度下用茴香霉素處理對于RPE細胞是非毒性的。圖8A示出顯示 用不同茴香霉素濃度處理或保持未處理的RPE細胞的SA-β-gal染色的代表性照片，如圖 所示出的。圖8B:將ARPE-19細胞接種在96孔板（5000細胞/孔）中，在完全培養基中， 并用TAK1抑制劑5Z-7-〇xozeaenol(1μΜ)、H202和茴香霉素單獨地或是組合地、或保持未 處理1小時。然后通過XTT試驗測定其生活力。實驗一式三份進行。
[0019] 所描述的序列的簡要描述
[0020] 如在37C.F.R. 1. 822中所限定的，對于核苷酸堿基使用標準字母縮寫，并且對于 氨基酸使用三字母編碼來顯示本文提供的核酸和/或氨基酸序列。只示出每種核酸序列的 一條鏈，但理解為通過對所顯示鏈的任何參考將互補鏈包括于其中。序列表作為于2014年 5月30日創建的、命名為M0RR5seqlist.txt的ASCII文本文件提交，其通過引用結合在此。 在所附序列表中：
[0021] SEQIDNO. 1是人類TAK1的氨基酸序列，同種型A。
[0022] SEQIDN0.2是人類TAK1的氨基酸序列，同種型B。
[0023]SEQIDN0.3是人類TAK1的氨基酸序列，同種型C。
[0024]SEQIDN0.4是人類TAK1的氨基酸序列，同種型D。
[0025]SEQIDN0.5是人類TAK1結合蛋白的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0026]I.縮寫
[0027] AMD年齡相關的黃斑變性
[0028]RPE視網膜色素上皮細胞
[0029] TAK1轉化生長因子β激活激酶1
[0030]II.術語
[0031] 除非另有說明，本文中所使用的技術術語和科學術語具有與由本公開所屬領域的 技術人員所通常理解的相同的含義。除非上下文中明確地另行指出，否則單數術語"一種 (a) "、"一個（an)"和"該（the)"包括復數指示物。類似地，除非上下文中明確地另行指出， 否則詞語"或"旨在包括"和"。雖然與本文中所描述的這些相似或等同的方法和材料可以 用在本發明的實踐或測試中，但是下面描述了適用的方法和材料。術語"包含（comprise)" 意為"包括（include)"。縮寫"例如（e.g.)"源自拉丁語exempligratia，而在本文中用 于指示非限制性實例。因此，縮寫"例如（e.g.)"與術語"例如（forexample)"同義。
[0032] 在沖突的情況中，以本發明的說明書，包括術語解釋為準。此外，所有材料、方法和 實例是不例性的而不旨在是限定性的。
[0033] 異常：偏離正常特征。正常特征可以在對照、針對群體的標準等中找到。例如，其 中異常病況是疾病病況，如視網膜退行性疾病，正常特征的一些合適來源可能包括未患有 該疾病（例如，干性AMD)的個體、認為不患有該疾病的個體的群體標準等。
[0034]同樣，異常可以參照與疾病相關聯的病況。術語"相關聯"包括發展疾病以及疾病 本身的增加的風險。例如，某種異常（例如減少的中心視覺）可以描述為與早期AMD的生 物學病況相關聯并趨向于發展晚期AMD和完全視覺喪失。
[0035] 給予：通過所選途徑將組合物，如經TAK1激活而激活p38和/或JNK信號的藥劑 引入受試者中。可以通過本領域技術人員已知的任何途徑給予活性化合物或組合物。給予 可以是局部的或全身的。局部給予的實例包括但不限于，局部給予、皮下給予、肌內給予、鞘 內給予、心包內給予、眼內給予、局部眼用給予或通過吸入給予給予鼻粘膜或肺。另外，局 部給予包括通常用于全身給予的給予途徑，例如通過直接血管內給予到供應特定器官的動 脈。因此，在特定實施方式中，當這樣的給予靶向供應特定器官的脈管系統時，局部給予包 括動脈內給予和靜脈內給予。局部給予還包括將活性化合物和藥劑引入可植入裝置或構造 中，如生物相容性眼內植入物，其經延長的