用于再生醫學和組織工程的可生物降解的網絡聚合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明一般地設及與生物環境兼容的可生物降解的網絡聚合物。本發明特別地設 及通過醋連接基（esterlinkage)交聯的可生物降解的聚酸網絡聚合物，包含所述可生物 降解的聚酸網絡聚合物的基質、植入物和支架，用于制備運類網絡聚合物、植入物和支架的 方法，W及使用包含所述網絡聚合物的基質、植入物和支架的方法，特別是用于培養細胞和 再生組織。
【背景技術】
[0002] 由于其在一系列生物醫學應用（例如組織工程）中的潛力，與生物環境兼容的聚 合物材料特別令人感興趣。已研究的用于運類應用中的聚合物材料通常是合成的或天然來 源的。
[0003] 天然的聚合物材料例如膠原、藻酸鹽、殼聚糖（Chitosan)和徑憐灰石已用于制備 祀向多種組織的組織工程應用中的支架。雖然運樣的天然材料有許多優點，但是關于其使 用也存在某些問題，例如，批次與批次的差異、疾病傳播的風險和免疫原性。此外，獲得運些 天然材料所需的加工方法可影響其物理特性。例如，雖然膠原在體內展示出高的機械強度， 但是由于天然交聯的損失，獲取、分離和純化的過程顯著降低了運種性質。
[0004] 在另一方面，合成的聚合物提供了勝過天然聚合物的某些優勢。運些優勢可包括 批次與批次間差異的減少，對聚合物結構的高度控制，W及調整聚合物組成和特性W適合 特定應用的能力。
[0005] 對于生物醫學應用，已經開發了基于聚酸聚合物的親水性材料，例如聚（乙二醇） (PEG)。特別對PEG進行了廣泛的研究，原因是其水溶性、非毒性、極低免疫原性和抗蛋白質 結垢性（anti-protein化ulingproperty),并且PEG已被美國食品和藥品管理局（FDA)批 準用于藥物和化妝品應用。在體外和體內的多種研究已證實用陽G制造的材料具有所期望 的生物相容性。
[0006] 對于細胞培養和組織工程應用，已經研究了基于聚酸的交聯聚合物網絡聚合物和 水凝膠例如PEG,并且多個研究小組已經對使用多種反應條件來構建陽G水凝膠進行了報 道。然而，雖然PEG聚合物和水凝膠一般是生物相容的，但是它們通常不是可生物降解的。
[0007] 已經通過將基于聚（a徑基酸）（例如聚（乳酸）和聚（乙醇酸））的聚合物片段 結合入（inco巧oration)水凝膠中制備了可降解的陽G水凝膠。然而，將聚（a徑基酸） 片段結合入PEG水凝膠中的一個問題是，聚（a徑基酸）片段可W是非常疏水的，運可能是 刺激主要的異物反應的重要因素。聚（a徑基酸）片段的另一個問題是當它們降解時，它 們能夠產生高局部濃度的酸，其可刺激炎癥反應。
[0008] 期望提供可解決或改善與現有的材料相關的一個或多個缺點和不足之可生物降 解的聚酸網絡聚合物和/或至少提供此類材料的可用的替代物。
【發明內容】
[0009] 在一個方面，本發明提供了通過醋連接基交聯的可生物降解的聚酸網絡聚合物， 其是通過使包含多官能聚酸單體和多官能交聯單體的單體組合物聚合而制備的，其中所述 聚酸單體和所述交聯單體之一包含徑基官能團并且所述聚酸單體和所述交聯單體之另一 包含能夠與所述徑基官能團反應形成醋連接基的互補官能團（complementary化nctional group),且其中選自聚酸單體和交聯單體的至少一者是支鏈的。
[0010] 聚酸網絡聚合物通過聚酸單體和交聯單體之間形成的醋連接基交聯。醋連接基在 生理條件下和水解作用下可水解，使得網絡聚合物發生降解。
[0011] 在另一個方面，本發明提供了用于制備通過醋連接基交聯的可生物降解的聚酸網 絡聚合物的方法，所述方法包括在允許所述聚酸單體和所述交聯單體之間形成醋連接基的 條件下，使包含多官能聚酸單體和多官能交聯單體的單體組合物進行反應的步驟，其中所 述聚酸單體和所述交聯單體之一包含徑基官能團并且所述聚酸單體和所述交聯單體之另 一包含能夠與所述徑基官能團反應形成醋連接基的互補官能團，且其中選自所述聚酸單體 和所述交聯單體的至少一者是支鏈的。
[0012] 根據本發明的一個或更多個方面，聚酸單體和交聯單體之一包含徑基官能團，而 聚酸單體和交聯單體之另一包含能夠與徑基官能團反應W形成醋連接基的互補官能團。在 一組實施方案中，互補官能團選自簇酸、簇酸醋、簇酸酢和簇酷面化物（carboxylicacid halide)。在一組具體的實施方案中，所述互補官能團是簇酷面化物。
[0013] 為了能夠形成聚酸網絡聚合物，所述聚酸單體和所述交聯單體的至少一種必須是 支鏈的。在一個實施方案中，所述聚酸單體是支鏈的。
[0014] 在本發明的一個或更多個方面的實施方案中，所述聚酸單體包含多個徑基官能 團。因此在運樣的實施方案中，所述交聯單體包含互補官能團。
[0015] 在一些實施方案中，聚酸單體是支鏈的并且具有式（I)的結構：
[001 引 A做)。（I)
[0017]其中：
[001引A是n價核屯、；
[0019] B是聚酸鏈段；
[0020] X是徑基官能團；并且
[0021] n表示度訝基團的數目且至少為3。
[0022] 在一些實施方案中，在聚酸網絡聚合物的制備中使用的聚酸單體包含衍生自 C2-C3二元醇的聚酸鏈段。
[0023] 在一組實施方案中，聚酸單體中的聚酸鏈段各自具有選自約IOODa至約 10,OOODa、約150Da至約SOOODa和約200Da至約1000 Da范圍內的分子量。
[0024] 在一些實施方案中，所述聚酸單體選自甘油乙氧基化物和季戊四醇乙氧基化物。
[0025] 在本發明的一個或更多個方面的實施方案中，所述交聯單體包含至少兩個能夠與 徑基官能團反應W形成醋連接基的互補官能團。在特定的一組實施方案中，所述交聯單體 包含至少兩個簇酷面化物官能團。
[0026] 在一種形式中，所述交聯單體可具有式（II)的結構：
[0027] ROOm(II)
[0028] 其中：
[0029] R是控基；
[0030] Y是選自簇酸、簇酸醋、簇酸酢和簇酷面化物的互補官能團（優選簇酷面化物官能 團）；并且
[0031] m表示Y基團的數目且至少為2。
[0032] 在一些實施方案中，式（II)的交聯單體可具有式（IIa)或（IIb)的結構：
[0033]
[0034] 其中：
[0035] R是控基；并且
[003引 Y是選自簇酸、簇酸醋、簇酸酢和簇酷面化物（優選簇酷面化物）的互補官能團。
[0037] 在式（II)、（IIa)和（Hb)的交聯單體的實施方案中，R可W是直鏈控基、支鏈控 基、環控基或芳香控基。在一些具體的實施方案中，R可包含2至12個碳原子。
[0038] 在一種形式中，所述交聯單體可選自班巧酷氯、己二酷氯、癸二酷氯、戊二酷氯、庚 二酷氯、辛二酷氯和均苯S甲酯氯（trimeso^chloride),優選班巧酷氯和癸二酷氯。
[0039] 用于制備可生物降解的聚酸網絡聚合物的單體組合物可包含摩爾比在約5 : 1至 1 : 5,或約3 : 1至1 : 3范圍內的聚酸單體與交聯單體。在一組實施方案中，聚酸單體 與交聯單體的摩爾比為約1 : 2。
[0040] 在一組實施方案中，用于制備可生物降解的聚酸網絡聚合物的單體組合物還可包 含機械性能（mechanicalproperty)改性劑。在一些實施方案中，單體組合物可包含多至 20% (w/w)、多至15% (w/w)或多至10% (w/w)的機械性能改性濟I。所述機械性能改性劑 可W是疏水性大分子或疏水性低聚物。
[0041] 當機械性能改性劑是疏水性大分子時，所述大分子可W是聚醋多元醇（polyester polyol),如二徑基聚（己內醋）（dihy化oxyPoly(Caprolactone))。
[0042] 在一組實施方案中，本發明的可生物降解的聚酸網絡聚合物是多孔的。在運樣的 實施方案中，可生物降解的聚酸網絡聚合物的平均孔直徑（porediameter)可在約1皿至 約3mm的范圍內。
[0043] 在一種形式中，聚酸單體和交聯單體之間的反應生成在聚酸網絡聚合物中產生孔 的氣態形式的縮合物（condensate)。
[0044] 在一組實施方案中，用于制備可生物降解的聚酸網絡聚合物的單體組合物還 可包含固體成孔劑（porogen)，例如，成孔劑顆粒。所述成孔劑顆粒的粒徑可在選自約 50Jim-lOOOJim、約100Jim-700Jim、約300Jim-600Jim的范圍內。在一些實施方案中，所述 成孔劑顆粒可包括鹽顆粒。
[0045] 本發明的可生物降解的聚酸網絡聚合物可用于一系列應用。
[0046] 在一個方面，提供了體外細胞培養基質，其包含根據本文描述的任一實施方案的 可生物降解的聚酸網絡聚合物。在一種形式中，所述細胞培養基質為膜的形式。
[0047] 在另一個方面，提供了可植入裝置，其包括包含根據本文描述的任一實施方案的 可生物降解的聚酸網絡聚合物的基質W及接種到該基質上的細胞。
[0048] 在另一個方面，提供了支架，其包含根據本文描述的任一實施方案的可生物降解 的聚酸網絡聚合物。在一些實施方案中，所述支架是多孔海綿的形式。
[0049] 在本發明的另一個方面，提供了用于制備通過醋連接基交聯的多孔可生物降解的 聚酸網絡聚合物的方法，所述方法包括在允許形成通過醋連接基交聯的聚酸網絡聚合物且 在原位生成在網絡聚合物內產生多個孔的氣態縮合物的條件下，使包含多官能聚酸單體和 多官能交聯單體的單體組合物進行反應的步驟，其中聚酸單體和交聯單體的一種包含徑基 官能團且聚酸單體和交聯單體的另一種包含能夠與所述徑基官能團反應形成醋連接基的 互補官能團，其中選自所述聚酸單體和交聯單體的至少一種是支鏈的。
[0050] 本發明還提供了在對象中再生組織的方法，所述方法包括在對象的期望部位植入 包含根據本文描述的任一實施方案的可生物降解的聚酸網絡聚合物的支架的步驟。在一組 實施方案中，所述組織是脂肪組織且所述支架植入到對象的乳房區域中。
[0051] 本發明還提供了培養細胞的方法，其包括在細胞培養的條件下，使細胞與包含根 據本文描述的任一實施方案的可生物降解的聚酸網絡聚合物的基質相接觸的步驟。
[0052] 本發明還提供了制備可植入裝置的方法，其包括提供包含根據本文描述的任一實 施方案的可生物降解的聚酸網絡聚合物的基質和用細胞接種該基質的步驟。在一種形式 中，所述裝置是用于在對象的眼中植入的眼植入物且所述細胞選自角膜上皮細胞和角膜內 皮細胞。
[0053] 本發明還提供了用于治療對象的病患或病癥的方法，其包括W下步驟：提供包含 含有根據本文描述的一個或更多個實施方案之可生物降解的聚酸網絡聚合物的基質的可 植入裝置并將細胞接種在基質上，W及在對象需要治療的部位植入所述裝置。在一些實施 方案中，疾病或病患是角膜內皮功能障礙，且所述方法包括在對象的眼睛中植入包含接種 在基質上的角膜內皮細胞的裝置的步驟，所述基質包含根據本文描述的一個或更多個實施 方案的可生物降解的聚酸網絡聚合物。
【附圖說明】
[0054] 本文將僅參考附圖舉例說明本發明的優選實施方案，其中：
[00巧]圖1是說明根據本發明的一個實施方案的通過甘油乙氧基化物（GE)、癸二酷氯 (SebCl)和二徑基rcL的反應合成可生物降解的聚酸網絡聚合物的方案。
[0056] 圖2示出了說明根據本發明的一些實施方案的具有不同量之機械性能改性劑 (PCL)的可生物降解的聚酸網絡聚合物在8周內的體外降解譜的圖。
[0057] 圖3示出了說明根據本發明的一些實施方案的（a)聚合物條件培養基和化）含有 不同量的PCL的可生物降解聚酸網絡聚合物的降解產物之細胞毒性評估之結果的圖。
[0058] 圖4示出了根據本發明的一個實施方案的（a)在組織培養板上培養的綿羊角膜內 皮細胞（cornealendothelialcell,CEC)的顯微圖像，W及化）在具有5wt%PCL的可生 物降解的聚酸網絡聚合物上培養的CEC的顯微圖像。
[0059] 圖5示出了（a)對照和化）植入綿羊角膜的可生物降解的聚酸網絡聚合物（PHF) 在植入后28天H&E染色切片的顯微圖像。
[0060] 圖6是示出了根據本發明的一個實施方案使用季戊四醇乙氧基化物牌）和癸二 酷氯（SebCl)制造可生物降解的多孔PEG海綿的方案。
[0061] 圖7示出了本發明的一個實施方案的可生物降解的多孔PEG海綿的掃描電子顯微 鏡（SEM)圖像。
[0062]圖8示出了（a)說明本發明的一個實施方案在對用季戊四醇乙氧基化物（PE)、癸 二酷氯（SebCl)和rcU2wt%)制備的可生物降解的多孔陽G海綿進行30個壓縮循環之壓 縮應力（compressivestress)相對應變的曲線圖，和化）說明了本發明的一些實施方案的 多種可生物降解的多孔陽G海綿的壓縮模量（compressivemo化Ii)的圖。
[0063] 圖9是示出了本發明的一個實施方案的可生物降解的多孔PEG海綿在8周內 (PBS，37°C)的體外降解的圖。
[0064] 圖10示出了說明（a)多孔陽G海綿條件培養基和化）多孔PEG海綿降解產物的 細胞毒性評估之結果的圖。
[0065] 圖11示出了W下圖像：(a)在植入和縫合之前，本發明的一個實施方案的用季戊 四醇乙氧基化物（P巧和癸二酷氯（SebCl)W及PCL(2wt% )制備的可生物降解的多孔PEG 海綿，（b)背側皮下袋的制備，（C)插入到背側袋的可生物降解的多孔PEG海綿，（d)在2周 時可生物降解的多孔PEG海綿外植體的宏觀橫截面，（e)在8周時可生物降解的多孔PEG 海綿外植體的宏觀橫截面，（f)在8周時可生物降解多孔PEG海綿外植體之放大的橫截面， 在2周時取出的可生物降解的多孔PEG海綿外植體的（g) 1.25X，化)10X和a) 20X放大 倍率的H&E染色切片和在8周時取出的可生物降解的多孔PEG海綿外植體的（j) 1. 25X、 似IOX和（1)20X放大倍率的H&E染色切片。
[0066] 圖12示出了（a) 16周后，植入的本發明的一個實施方案的用季戊四醇乙氧基化 物牌）和癸二酷氯（SebCl)化及rcU2wt% )制備的可生物降解的多孔PEG海綿的位置， 化）在16周時取出的可生物降解的多孔PEG海綿的宏觀橫截面，（C)其中植入了可生物 降解的多孔PEG海綿之組織的H&E染色切片，在2周取出的可生物降解的多孔PEG海綿的 (d)1.25X、（e)lOX和訊20X放大倍率的邸1染色切化在8周時取出的可生物降解的 多孔PEG海綿的（g) 1.25X、化)IOX和（i) 20X放大倍率的EDl染色切片，和在16周時在 植入位置之組織的（j)1.25X、（k)lOX和（1)20X放大倍率的邸1染色切片。
[0067] 圖13示出了本發明的一個實施方案之用鹽模板與（a)班巧酷氯交聯單體和2wt% 的PCL(b)癸二酷氯交聯單體和%的rcL和（C)均苯S甲酯氯交聯單體和%的PCL 形成的可生物降解的多孔陽G海綿的化Viro-SEM圖像。
[0068] 圖14示出了（a)說明根據本發明的一些實施方案的用鹽模板與不同wt%的PCL 制備的可生物降解的多孔PEG海綿的壓縮模量的圖，和化）說明一個實施方案的用鹽模板、 癸二酷氯交聯單體和%的rcL制備的可生物降解的多孔PEG海綿在15個壓縮循環過程 中的壓縮應力相比應變的曲線圖。
[0069] 圖15說明了示出根據本發明的一些實施方案的用不同的交聯單體和鹽模板制備 的可生物降解的多孔PEG海綿在8周內（PBS，37°C)的體外降解的圖。
[0070] 圖16示出了說明（a)條件培養基和化）從用不同的交聯單體制備的本發明的一 些實施方案之多孔PEG海綿獲得的降解產物的細胞毒性評估的結果。
[0071] 圖17示出了（a)根據本發明的一些實施方案的用于植入用鹽模板和癸二酷氯交 聯單體制備的可生物降解的多孔PEG海綿之制備的皮下袋，（b)植入和縫合前的可生物降 解的多孔PEG海綿，（C)插入并縫合到背側袋的可生物降解的多孔PEG海綿。（d)在2周 后，在從植入位置切除之前可生物降解的多孔PEG海綿，（e)在2周時，可生物降解的多孔 PEG海綿外植體的宏觀橫截面，訊在8周時，可生物降解的多孔PEG海綿外植體，在2周時 取出的可生物降解的多孔PEG海綿的（g)1.25X，化)10X和a)20X放大倍率的H&E染色 切片，在8周時取出的可生物降解的多孔PEG海綿（j)1.25X、（k)lOX和（1)20X放大倍 率的H&E染色切片。
[0072] 圖18示出了（a)在16周取出的根據本發明的一些實施方案的用鹽模板和癸二酷 氯交聯單體制備的可生物降解的多孔PEG海綿之宏觀橫截面，植入可生物降解的多孔PEG 海綿外植體之組織的（b) 1. 25X、（C)IOX放大倍率的H&E染色切片，在2周時取出的可生 物降解的多孔PEG海綿的（d)1.25X、（e)lOX和（f)20X放大倍率的EDl染色切片，在8 周時取出的可生物降解的多孔PEG海綿的（g)1.25X、化）10X和a)20X放大倍率的邸1 染色切片，W及在16周時在植入位置之組織的（j) 1. 25X、化)IOX和（1)20X放大倍率的 EDl染色切片。
【具體實施方式】
[0073] 本發明設及通過醋連接基交聯的可生物降解的聚酸網絡聚合物和用于制備運些 網絡聚合物的方法。包含在聚酸網絡聚合物中的醋連接基是可生物降解的且在生物環境中 是可水解和/或酶促裂解的，使得交聯的網絡聚合物分解。從網絡聚合物的分解產生的降 解產物對于身體基本上是無毒的。
[0074] 本文相對于物質、連接基或基團所使用的術語"可降解的"和"可生物降解的"意味 著該物質、連接基或基團在生理條件下或在生物環境中隨著時間的推移易于降解、裂解或 破碎。在選定的生理或生物條件下，此類降解、裂解或碎片可通過合適的不穩定部分的化學 分解（例如，通過水解或還原）而發生。當相對于聚合物物質使用時，術語"可降解的"和 "可生物降解"表明該聚合物包含合適的不穩定或可降解的部分作為該聚合物分子結構的 一部分。聚合物中一種或更多種可降解部分的裂解或分解通常導致聚合物碎裂為單體和/ 或低分子量的聚合物片段。
[00巧]在一個方面，本發明提供了通過醋連接基交聯的可生物降解的聚酸網絡聚合物， 其是通過使包含多官能聚酸單體和多官能交聯單體的單體組合物聚合而制備的，其中聚酸 單體和交聯單體之一包含徑基官能團并且聚酸單體和交聯單體之另一包含能夠與所述徑 基官能團反應形成醋連接基的互補官能團，且其中選自聚酸單體和交聯單體中的至少一者 是支鏈的。
[0076] 為了形成可生物降解的聚酸網絡聚合物，使用包含多官能聚酸單體和多官能交聯 單體的單體組合物。存在于所述單體組合物中的聚酸單體和交聯單體各自包含能夠共價反 應的官能團W便聚合并形成可生物降解的聚酸網絡聚合物。由聚合反應形成的聚酸網絡聚 合物是固體且不溶的聚合物基質。
[0077] 包含在單體組合物中的聚酸單體和交聯單體中的至少