一種治療潰瘍性結腸炎的復合益生菌、藥物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種治療潰瘍性結腸炎的復合益生菌、藥物及其制備方法，即兩株益 生菌聯合使用的藥物，屬于醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis,UC)是炎癥性腸病（infIammatoiybowel disease,IBD)的一個主要類型，是一種原因不明的慢性非特異性腸道炎癥。資料顯示，每年 美國UC患病率為200/10萬人，治療UC的花費在1至1. 5億美元左右，截止到2012年，UC 患者總數是2000年的2. 5倍，且復發率達72% ;近年來我國UC的患病人數呈明顯上升趨 勢。潰瘍性結腸炎病變主要位于結腸粘膜和粘膜下層；臨床表現為腹瀉，黏液脈血便，腹痛， 里急后重等，多呈反復發作的慢性病程。目前治療潰瘍性結腸炎的方法主要包括藥物治療、 營養治療、屯、理治療及手術治療，其中藥物治療是最主要的方法。在臨床上用于治療UC的 藥物主要有氨基水楊酸類藥物、腎上腺糖皮質激素類和免疫抑制劑類等。總體來說，上述藥 物治療見效快、療效好，可緩解UC患者燃眉之苦，但仍存在很多問題。首先，無法根治患者 UC，治標不治本；其次，不良作用大，易引起患者頭疼、惡屯、，造成機體消化系統、血液系統異 常；然后，潛在的致毒致癌性；最后，抗生素類藥物（如應用最廣的SAS巧易導致機體耐藥 抗藥性。
[0003] 益生菌可通過與有害菌競爭位點來調節腸道菌群平衡，而且部分植物乳桿菌可產 生細菌素，抑制有害菌的增殖；部分嗜酸乳桿菌具有很好的益生作用。而植物乳桿菌和嗜酸 乳桿菌的種類繁多，并不是所有的菌株均具有調節腸胃的功能，也不是所有的益生菌一起 使用均能發揮出各自的功效，更不是所有的益生菌聯合使用都能達到協同增效的作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一是提供一種復合益生菌，可W有效的治療潰瘍性結腸炎。 陽〇化]另一個目的是利用復合益生菌治療潰瘍性結腸炎的藥物，通過采用對腸道效果較 好的嗜酸乳桿菌(Xactobacillusacidophilus)CGMCC10436和植物乳桿菌(Xactobacillus plantarum)CGMCC9961聯合使用，協同增效，可W有效的治療潰瘍性結腸炎，并且毒副作用 較小，不易產生抗性。
[0006] 本發明的另一個目的是提供一種利用益生菌治療潰瘍性結腸炎的藥物的制備方 法。
[0007] 為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0008] 治療潰瘍性結腸炎的復合益生菌，所述的復合益生菌包括嗜酸乳桿菌CGMCC10436 和植物乳桿菌CGMCC9961，所述的嗜酸乳桿菌CGMCC10436的菌體數量占復合益生菌菌體總 數量的10~90%。
[0009] 優選地，上述治療潰瘍性結腸炎的復合益生菌中，所述嗜酸乳桿菌CGMCC10436和 植物乳桿菌CGMCC9961的菌體數量比為1: 1。
[0010] 所述的復合益生菌可W制成藥物制劑、飲料、酸奶、奶片等形式。 1] 本發明采用的嗜酸乳桿菌CGMCC10436的保藏編號為CGMCCNO. 10436,保藏日期 為2015年Ol月26號，所述植物乳桿菌CGMCC9961的保藏編號為CGMCCNO. 9961，保藏日 期為2014年11月13號，保藏單位均為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0012] 本發明還公開了一種利用上述復合益生菌治療潰瘍性結腸炎的藥物。
[0013] 優選地，上述治療潰瘍性結腸炎的藥物中，所述嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳 桿菌CGMCC9961的總用量均為lXl〇iiCFU/kg，即每千克的動物、人體等所用的藥物中嗜酸 乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961的總數量為1XIQiiCRJ，具體地，可W根據實 際情況進行計算，比如，一個重量為20g的大鼠，其用藥中含有嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植 物乳桿菌CGMCC9961的總數量為2X1〇9cFU;-個重量為50kg的人，其用藥中含有嗜酸乳桿 菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961的總數量為5X1〇i2CRJ。
[0014] 優選地，所述的嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961均為活菌菌體形 式，且所述的活菌菌體是由均處于穩定初期的乳桿菌液體培養物分別離屯、收集的菌泥。
[0015] 本發明還公開了治療潰瘍性結腸炎的藥物的制備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)分別將嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961在MRS培養基培養 12 ~16h;
[0017] (2)分別取步驟（1)得到的嗜酸乳桿菌CGMCC10436菌液40~60份和植物乳桿 菌CGMCC9961菌液10~30份，離屯、取菌泥，然后分別將它們溶于1份無菌PBS中，得混合 困泥；
[0018] (3)將上述混合菌泥攬拌均勻，然后加入合適的輔料制成臨床可接受的劑型。
[0019] 優選地，上述治療潰瘍性結腸炎的藥物的制備方法，包括如下步驟：
[0020] (1)分別將嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961在MRS培養基培養 14h； W21 ] 0)分別取步驟（1)得到的嗜酸乳桿菌CGMCC10436菌液50份，植物乳桿菌 CGMCC9961菌液20份，離屯、取菌泥，然后分別將它們溶于1份無菌PBS中，得混合菌泥；
[0022] (3)將上述混合菌泥攬拌均勻，然后加入合適的輔料制成臨床可接受的劑型。
[0023] 更優選地，步驟（2)所取的嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961均處 于對數期末穩定期初。
[0024] 所述的劑型包括注射液、膠囊劑、粉劑、顆粒劑等一切可W制成的劑型。
[00巧]本發明的有益效果：
[0026] 本發明選用的嗜酸乳桿菌CGMCC10436、植物乳桿菌CGMCC9961屬于發明人新發現 的菌株，經過對其研究發現，兩者均具有較好的抗潰瘍性結腸炎作用，兩個聯合使用后，效 果顯著增加，具有明顯的協同增效作用，起到了預料不到的效果。具體表現在顯著改善潰瘍 性結腸炎小鼠的表觀狀態，增加小鼠病理學評分，并降低小鼠炎癥性反應。
【附圖說明】
[0027]圖1為腸炎組小鼠表觀狀態圖； 陽02引圖2為腸炎組小鼠表觀狀態特寫；
[0029] 圖3為腸炎組小鼠肥染色圖；
[0030] 圖4為本發明藥物組小鼠表觀狀態圖；
[0031] 圖5為后續觀察本發明藥物組小鼠表觀狀態；
[0032] 圖6為不同組小鼠結腸組織宏觀病理學評分。
【具體實施方式】
[0033] 實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該 理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可W對本發明技術方案的細節和形式進行修改 或替換，但運些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。本發明所采用的各種材料、試劑或 用具如無特殊說明，均可W從市場中獲得。
[0034] 一、嗜酸乳桿菌CGMCC10436和植物乳桿菌CGMCC9961的分離
[0035] 從內蒙古錫林郭勒盟、海拉爾市及鄂爾多斯市等地區的牧民家中采集傳統方法制 作的傳統稀奶油或酸化奶油，用于乳酸菌的篩選。具體如下：
[0036] (1)將25g樣品在無菌條件下剪碎，溶于225血無菌生理鹽水中，梯度稀釋后選擇 合適的稀釋度，取ImL稀釋液加入無菌平皿，傾注于20mLMRS固體培養基上，30°C培養72h。
[0037] (2)選取菌落數量在15~150的平板，隨機選取符合乳酸菌菌落形態特征的菌落， 從中挑取少量細菌，溶于于MRS液體培養基中，并進行30°C培養4她。
[003引做將分離到的菌株在MRS固體培養基上反復劃線進行純化。
[0039] (4)將純化好的菌株均進行革蘭氏染色及過氧化氨酶實驗。
[0040] (5)將所有革蘭氏陽性、過氧化氨酶陰性、不形成芽抱的菌株（初步判斷為乳酸 菌）選出來，在其培養液中加入甘油，使甘油的最終濃度為30% (v/v)，膽藏于-80°C待用。
[0041] (6)將上述分離到暫定為乳酸菌的菌株分別在MRS液體