經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及人用流感疫苗制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒容易變異、傳染性強(qiáng)、傳播 速度快。流感流行給人類(lèi)帶來(lái)深重災(zāi)難,而且嚴(yán)重影響?zhàn)B禽事業(yè)的發(fā)展。流感病毒呈多形 性,有球狀體和絲狀體,為單股負(fù)鏈RNA病毒。球形病毒顆粒內(nèi),螺旋狀的核殼體為病毒內(nèi) 核,由核蛋白(nucleoprotein,N巧和多聚酶蛋白(RNA多聚酶成分:PB1、PB2、PA)組成核 衣殼蛋白(ribonucleop;rotein,RNP),與RNA連接。中層為蛋白殼,含有基質(zhì)蛋白(matrix, Ml)和膜蛋白(membraneprotein,M2)。外層來(lái)自宿主細(xì)胞的雙層類(lèi)脂囊膜,囊膜上有血凝 素化emagglutinin,HA)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)和M2蛋白構(gòu)成的突起。M2是跨 膜離子通道蛋白,一部分在病毒中層,一部分在病毒外層。病毒表面釘狀物是棒狀=聚體的 HA和磨茹形的四聚體的NA,與黏多糖和糖蛋白具有親和力,與細(xì)胞表面含唾液酸的受體具 有更強(qiáng)親和力。甲型和乙型流感病毒基因組有8個(gè)基因片段,分別編碼10種蛋白,其中8種 是病毒顆粒的組成成分(HA、NA、NP、Ml、M2、PBl、PB2和PA),另兩段RNA基因片段編碼非結(jié) 構(gòu)蛋白一NSl和NS2。運(yùn)10種蛋白區(qū)分為表面蛋白、內(nèi)部蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。HA、NA和M2 是表面蛋白;內(nèi)部蛋白包括PB1、PB2、PA、由PBl基因編碼的PB1-F2、NP、Ml和NS2 ;NS1產(chǎn) 生于感染細(xì)胞,不包裝在病毒顆粒內(nèi)。根據(jù)核蛋白和膜蛋白抗原的差異,流感病毒分為甲、 乙、丙=型。甲型流感病毒由于血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原的不同,又分為不同亞型。血凝素 有16個(gè)亞型,神經(jīng)氨酸酶有9個(gè)亞型。任何一種HA和任何一種NA都構(gòu)成一種血清型。
[0003] 裂解型流感滅活疫苗,是建立在流感全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上,通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)?裂解劑和裂解條件裂解流感病毒,去除病毒核酸和大分子蛋白,保留抗原有效成分HA和NA W及部分M蛋白和NP蛋白,經(jīng)過(guò)不同的生產(chǎn)工藝去除裂解劑和純化有效抗原成分制備而 成。1968年流感裂解疫苗(inactivatedsplitvirusvaccines)開(kāi)始大規(guī)模生產(chǎn),疫苗除 含有表面抗原HA和NA外,還含有病毒核殼體和基質(zhì)蛋白。免疫原性良好,不良反應(yīng)輕,因 此,裂解疫苗成為目前流感疫苗主流產(chǎn)品。
[0004] 目前用于免疫人群的疫苗主要是針對(duì)甲(A)型流感病毒化Nl亞型、冊(cè)N2亞型W 及乙度)型流感病毒的=聯(lián)滅活疫苗。
[0005] 流感病毒同許多病原體一樣,侵染黏膜表面,首先是上呼吸道黏膜表面。黏膜免疫 構(gòu)成了宿主的第一道防線(xiàn),是鼻道和下呼吸道免疫反應(yīng)的主要組成部分。盡管目前使用的 注射流感疫苗在大部分健康個(gè)體中刺激血清HA-特異性IgG,但僅有小部分接種者HA-特異 性IgA抗體出現(xiàn)顯著上升。免疫原性和臨床效力更佳的改進(jìn)流感疫苗必須W能激發(fā)局部抗 體反應(yīng)和系統(tǒng)抗體反應(yīng)運(yùn)兩者為目標(biāo)。
[0006] 黏膜免疫提供了替代傳統(tǒng)免疫的新途徑。黏膜免疫可W從病原入侵人體開(kāi)始發(fā)揮 作用并且感染不易擴(kuò)散。此外,黏膜免疫還具有W下優(yōu)點(diǎn):免疫方便、可降低成本大面積人 群免疫、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員、避免無(wú)菌針頭和衛(wèi)生不足引起交叉感染。
[0007] 第一個(gè)經(jīng)鼻黏膜免疫的流感疫苗2001年歐洲上市,后因潛在毒性問(wèn)題撤市。第二 個(gè)產(chǎn)品是醫(yī)學(xué)免疫(MedImmune)公司的鼻腔噴霧給藥流感病毒活疫苗(InfluenzaVirus VaccineLive,商品名:FluMist),用于2-49歲人群預(yù)防流感A型或B型病毒。2003年被 美國(guó)FDA批準(zhǔn)后,成為美國(guó)首個(gè)用于健康成人的鼻腔噴霧給藥流感疫苗。FIuMist與傳統(tǒng)的 流感疫苗相比有兩個(gè)特點(diǎn):一是含弱活流感病毒而不是死病毒,它們能在鼻和咽部生長(zhǎng),但 在溫度較高的下呼吸道不能生長(zhǎng);二是經(jīng)鼻腔噴霧免疫而不需注射接種。
[0008] 對(duì)于經(jīng)鼻給予滅活流感疫苗而言,因?yàn)檩^活病毒免疫原性低,不易產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 相關(guān)研究雖然很多,但均沒(méi)有達(dá)到國(guó)際通行的有效免疫標(biāo)準(zhǔn),或者給予次數(shù)和抗原量在商 業(yè)上不可行。迄今為止,滅活流感疫苗的經(jīng)鼻免疫制劑尚未見(jiàn)臨床應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)鼻給藥的滅活流感疫苗免疫制劑及其制備方法,W滿(mǎn) 足臨床應(yīng)用的需要。
[0010] 所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑,含有如下配比的組分:
[0011] WHA汗,各價(jià)滅活流感疫苗 50~KOmg 免疫增強(qiáng)劑 1-5婚 滲透壓調(diào)節(jié)劑 0~9g P掃調(diào)節(jié)劑 0~30g 水 1000 mL
[0012] 所述的滅活流感疫苗為甲型流感病毒化Nl亞型、冊(cè)N2亞型W及乙型流感病毒的 單價(jià)、二價(jià)或=聯(lián)滅活疫苗,也可W是其他亞型的流感疫苗;
[0013] 所述的免疫增強(qiáng)劑選自烷基糖巧、殼聚糖、低酷基結(jié)冷膠或脂質(zhì)體;
[0014] 所述的抑調(diào)節(jié)劑選自憐酸鹽緩沖液(抑=6~8)、冰醋酸-醋酸鋼緩沖液(pH4~ 5)或其他緩沖鹽。
[0015] 所述的滲透壓調(diào)節(jié)劑選自氯化鋼、氯化鐘、葡萄糖等。
[0016] 術(shù)語(yǔ)"HA",指的是流感病毒包膜表面柱狀抗原,能與人、雞、豚鼠等多種紅細(xì)胞受 體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集,具有免疫原性。為保護(hù)型抗原,其誘導(dǎo)的抗體為血凝抑制抗體,能 抑制血凝現(xiàn)象。功能:凝集紅細(xì)胞,吸附宿主細(xì)胞,具抗原性,不穩(wěn)定性,是劃分亞型的依據(jù)。 在國(guó)際病毒學(xué)雜志2010年8月第17卷第四期《流感疫苗的現(xiàn)狀與未來(lái)》中,對(duì)其有明確的 定義,可W用于計(jì)量滅活流感疫苗的用量;
[0017] 所述的烷基糖巧優(yōu)選烷基部分由6-20個(gè)碳的烷基糖巧,糖巧為麥芽糖巧、薦糖巧 或葡萄糖巧;最優(yōu)選十二/十四烷基-葡萄糖糖巧;
[001引所述的殼聚糖的脫乙酷度85%W上,分子量為5~100萬(wàn);
[0019] 所述的低酷基結(jié)冷膠為結(jié)冷膠中的一種,所述的結(jié)冷膠又稱(chēng)凱可膠,是一種高分 子線(xiàn)性多糖,由4個(gè)單糖分子組成的基本單元重復(fù)聚合而成.其基本單元是由1,3-和1, 4-連接的2個(gè)葡萄糖殘基,1,3-連接的1個(gè)葡萄糖醒酸殘基,和1,4一連接的1個(gè)鼠李糖 殘基組成。其中葡萄糖醒酸可被鐘、鋼、巧、儀中和成混合鹽。并且天然結(jié)冷膠含有0-酷基 (甘油酷基和乙酷基)。天然或稱(chēng)高酷基結(jié)冷膠可形成高彈性低硬度凝膠。乙酷化結(jié)冷膠 通過(guò)堿處理除去O-酷基后生成低酷基結(jié)冷膠,再經(jīng)過(guò)濾可得到純化低酷基結(jié)冷膠,即商品 結(jié)冷膠,其相對(duì)分子質(zhì)量約為50萬(wàn)。結(jié)冷膠在陽(yáng)離子存在時(shí),在加熱后冷卻時(shí)生成堅(jiān)硬脆 性凝膠。其硬度與結(jié)冷膠濃度成正比,并且在較低的二價(jià)陽(yáng)離子濃度時(shí)產(chǎn)生最大凝膠硬度。
[0020] 所述的脂質(zhì)體由卵憐脂或憐脂衍生物與膽固醇組成,也可含有其他成分如十八胺 等,制備方法可參見(jiàn)《徑基喜樹(shù)堿脂質(zhì)體的制備與性質(zhì)研究》、《脂質(zhì)體作為干擾素-a載體 的研究》等文獻(xiàn)
[0021] 本發(fā)明的制備方法之一,包括如下步驟:
[0022] 將烷基糖巧加入所述的憐酸鹽緩沖鹽溶解,獲得烷基糖巧溶液;
[0023] 將所述的滅活流感疫苗與所述的烷基糖巧溶液混合,獲得所述的經(jīng)鼻給藥的流感 疫苗免疫制劑;
[0024] 本發(fā)明的制備方法之二,包括如下步驟:
[00巧]將殼聚糖加入所述的冰醋酸-醋酸鋼緩沖液溶解,然后與所述的滅活流感疫苗混 合,獲得所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑;
[0026] 本發(fā)明的制備方法之S,包括如下步驟:
[0027] 將低酷結(jié)冷膠加入水溶解,然后與所述的滅活流感疫苗混合,獲得所述的經(jīng)鼻給 藥的流感疫苗免疫制劑;
[0028] 本發(fā)明的制備方法之四,包括如下步驟:
[0029] (1)將處方量卵憐脂或憐脂衍生物、膽固醇,加無(wú)水乙醇或氯仿等溶劑,加熱、溶 解,恒溫水浴真空下蒸發(fā)溶劑成膜;
[0030] (2)將所述的滅活流感疫苗用所述的憐酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)缓笈c上述憐脂膜一起 充分震蕩水化,形成脂質(zhì)體混懸液,即可獲得所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑;
[0031] 本發(fā)明還設(shè)及一種經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫凍干制劑,是采用如下重量百分比的 組分制備的:
[0032] 干基所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑100份
[0033] 甘露醇、薦糖、乳糖或其他凍干保護(hù)劑 50~900份
[0034] 干基所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑為不含有水的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免 疫制劑;
[0035] 制備方法,包括如下步驟:
[0036] 將所述的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑與甘露醇、薦糖、乳糖或其他凍干保護(hù)劑 混合,然后采用本領(lǐng)域公知的方法,冷凍干燥,即可獲得經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫凍干制 劑,臨用前復(fù)溶。
[0037] 本發(fā)明可W通過(guò)溶液形式滴鼻或鼻腔噴霧進(jìn)行免疫,也可W適當(dāng)形式干燥后鼻腔 粉末霧化給藥。
[0038] 在上述流感疫苗鼻腔給藥組合物中,除了上述提及的配方組合材料外,還可W添 加其他免疫增強(qiáng)劑,滲透壓調(diào)節(jié)劑,抑調(diào)節(jié)劑或者幫助免疫組合物穩(wěn)定的其他材料,如凍干 保護(hù)劑等。
[0039] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:研制的流感疫苗經(jīng)鼻免疫組合物,不需要注射給藥,產(chǎn)生的免 疫效果與肌肉注射效果相當(dāng)。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 處方:
[0042] W M計(jì),滅活流感疫苗每種亞型 75mg 十二/十四烷基-葡萄糖糖昔(APG1214) IOg 氯化鋼 8.5g 磯酸氨二納 1 .〇96g 一水稱(chēng)酸二氨鋼 0.316g 氷 WOOmL
[0043] 所述的免疫增強(qiáng)劑為十二/十四烷基-葡萄糖糖巧,抑調(diào)節(jié)劑為憐酸鹽緩沖鹽 (0.OlmM,pH= 7. 2);滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鋼。
[0044] 制備方法:
[0045] 將烷基糖巧加入所述的憐酸鹽緩沖液溶解,獲得烷基糖巧溶液;
[0046] 將所述的滅活流感疫苗與所述的烷基糖巧溶液混合,并加入其他組分,獲得所述 的經(jīng)鼻給藥的流感疫苗免疫制劑。2~8°C保存。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 處方:
[0049] W HA計(jì),滅活流感疫苗每種亞型 75mg 殼聚糖(日0萬(wàn)分子量,脫玄醜度90%) IOg 冰醋酸 9.8ml 醋酸鋼 ISg 恭 1000 mL
[0050] 所述