一種聯合輸送核酸與多肽的納米制劑及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種藥物技術領域的藥物輸送方法，具體地，涉及一種聯合輸送 核酸與多肽的納米制劑及制備方法，特別是一種可用于兩種或兩種以上生物大分子藥物的 聯合治療疾病的生物藥物制劑。
【背景技術】
[0002] 癌癥是人類面臨的難以治愈的重大疾病之一，目前采用的化療、放療和外科手術 的方法存在毒性大、缺乏靶向性、對正常組織與細胞傷害大，和以及切除不干凈等弊端，并 且開發新的小分子藥物周期長花費大。而生物大分子藥物（如多肽、核酸與蛋白質）具有 特定的治療靶點、毒性小。特別是核酸與多肽藥物結構明確、制備時間短。但生物大分子 藥物大多在體內易被降解難以到達治療位點，因此需要有合適的載體輸送其到達特定的病 變細胞內的治療位點。近年來，隨著生物大分子藥物的治病機理的逐漸明確，核酸、多肽以 及蛋白藥物成為研究的新的亮點。目前，核酸藥物的載體報道的非常多，如文獻[Yin，H等 人，用于基因治療的非病毒載體，自然評論遺傳學，2014, 15, 541-55]中的記載。但多肽藥 物的載體研究較少，事實上，多肽藥物分子量較小，靶點明確，在阻斷或調控病變基因方面 發揮著重要的作用，參見文獻[Ellerby，H.M等人，靶向促凋亡肽的抗腫瘤活性，自然醫學， 1999, 5, 1032-8]中的記載。
[0003] 如果我們能夠設計出同時有效輸送多肽與核酸的載體，那將為生物大分子的輸送 治療做出突破性工作。本發明利用對人體安全的生物醫用材料，構建出同時輸送核酸藥物 與多肽藥物的生物響應性載體。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有多肽與核酸輸送技術中的不足，提供一種聯合輸送核 酸與多肽的納米制劑及制備方法，所述納米制劑可以同時革G向輸送多肽藥物與核酸藥物。
[0005] 本發明涉及用核酸、陽離子多肽（如表1)、陽離子脂質體組裝的三元納米顆粒，以 及在此基礎上包裹透明質酸的四元納米顆粒。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] 第一方面，本發明提供一種聯合輸送核酸與多肽的納米制劑的制備方法，包括以 下步驟：
[0008] A、將多肽與陽離子脂質體混合；
[0009] B、將步驟A的混合液加入到核酸藥物中孵育制備得到三元納米顆粒；所述三元納 米顆粒為表面帶正電荷的納米顆粒；
[0010] C、向所述三元納米顆粒中加入透明質酸鈉水溶液，混合均勻，放置得四元納米顆 粒，即所述納米制齊1J。所述四元納米顆粒為表面帶負電荷的可以革G向到腫瘤細胞的納米顆 粒。
[0011] 優選地，步驟A中，所述陽離子脂質體通過以下步驟制得：將質量比為0. 5~2:1 的陽離子脂質與中性脂質的氯仿溶液，旋轉蒸發掉溶劑，然后水合過夜，超聲30-60分鐘。
[0012] 優選地，所述陽離子脂質為2, 3-二油酰基-丙基-三甲胺、2, 3-二油酰氧丙 基-1-溴化三甲胺，或其它合成的兩親性陽離子脂質；所述中性脂質為二油酰磷脂酰乙醇 胺或其它合成的兩親性具有融膜作用的中性脂質。
[0013] 優選地，步驟A中，所述多肽包括通過步驟Al制備得到的其中一種或多種多肽和 通過步驟A2制備得到的其中一種或多種多肽的混合物：
[0014] AU將多肽藥物與陽離子多肽通過可降解鍵連接起來獲得；
[0015] A2、先將靶向多肽或腫瘤細胞穿透肽與陽離子多肽通過不同的間隔肽序列來制備 多功能多肽。
[0016] 優選地，所述多肽包括如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3中的一種或 多種的組合，其氨基酸序列如表1所示。
[0017] 表 1
[0019] 所述Pa與Pb的制備為利用可降解的鍵將作為多肽藥物的GGWYRQV序列與聚精氨 酸（Rll)通過不同的序列端連接起來即構建得到兩個可以不斷降解釋放多肽藥物GGWYRQV 的多肽Pa與Pb。
[0020] 優選地，所述多肽為Pl與Pa或Pb按質量比為1: (0~4)的組合。
[0021] 優選地，所述陽離子脂質體、多肽和核酸藥物的質量比為（0. 5~2) : (2~7) : 1進 行混合。
[0022] 優選地，步驟A中，所述核酸藥物是指DNA，siRNA，shRNA，以及microRNA。
[0023] 優選地，步驟A中，所述孵育為常溫下孵育25-35分鐘。
[0024] 第二方面，本發明還提供一種通過所述的制備方法制備得到的納米制劑。
[0025] 本發明可用于生物大分子核酸與多肽聯合輸送的納米制劑是通過模塊化組裝而 成，各組分之間沒有通過化學共價鍵連接。模塊化組裝，是指各組分之間通過靜電作用、疏 水作用以及氫鍵等非共價鍵組裝形成的納米顆粒。
[0026] 第三方面，本發明還提供一種聯合輸送核酸與多肽的納米制劑在治療疾病中的用 途。
[0027] 本發明針對生物大分子核酸與多肽藥物在體內易降解和難以到達靶細胞的缺點， 采用對人體安全的多功能陽離子多肽和陽離子脂質體/核酸非病毒載體同時包裹多肽藥 物與核酸藥物形成納米顆粒，制備出可以利用多肽與核酸聯合治療疾病的生物大分子藥物 載體。該載體的特點是利用模塊組裝的原理，將陽離子脂質、含有特定細胞靶向肽或細胞穿 透肽的多功能陽離子多肽與多肽藥物進行混合，然后通過靜電作用與核酸藥物組裝成表面 帶正電的納米顆粒，并進一步通過靜電作用和氫鍵覆蓋透明質酸進一步形成表面帶負電荷 的納米靶向顆粒。其優勢是同時裝載多肽藥物與核酸藥物，通過多肽藥物與聚精氨酸之間 可降解的鍵的斷裂來實現多肽藥物的不斷釋放，通過載體的解組裝實現核酸的有效釋放。
[0028] 本發明方法與現有的Iipopolyplexes相比，不僅避免了聚陽離子的毒性（多肽是 人體內源性分子），而且有效突破了通過PEG化實現體內長效循環的弊端。兼顧到達靶細胞 之前的穩定性和進入靶細胞之后的生物響應性。
[0029] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0030] 本發明利用陽離子多肽與陽離子脂質體聯合包裹核酸與多肽藥物，然后在該納米 體系的外表面緊密包裹透明質酸，形成表面帶負電荷的納米顆粒，該納米顆粒可以特定靶 向腫瘤細胞，通過細胞穿透或者受體介導的方式進入內涵體，外面的透明質酸與多肽在內 涵體內降解，暴露出的脂質通過融膜作用進入細胞質。然后解組裝釋放出核酸藥物和多肽 藥物。由于多肽分布在整個納米顆粒內部，所以在進入細胞后通過調節多肽藥物與聚精氨 酸的連接鍵的降解速度來控制多肽藥物的釋放位點。
【附圖說明】
[0031] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0032] 圖1為四元納米顆粒的示意圖；
[0033] 圖2為四元納米顆粒的凝膠電泳圖；
[0034] 圖3為四元納米顆粒HLPD的Zeta電位圖；
[0035] 圖4為四元納米顆粒HLPD的粒徑圖；
[0036] 圖5為四元納米顆粒HLH)被肝癌細胞H印G2內吞圖；
[0037] 圖6為四元納米顆粒HLPD的肝癌細胞H印G2細胞螢光素酶轉染活性圖；
[0038] 圖7為四元納米顆粒HLPD的肝癌細胞HepG2細胞的毒性圖；
[0039] 其中，H代表透明質酸；L代表陽離子脂質體；D代表DNA。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明 的保護范圍。
[0041] 本發明對包裹生物大分子核酸藥物的四元納米顆粒的物化性質表征方法包括：凝 膠電泳、動態光散射和Zeta電位；初步的轉染活性與毒性實驗的DNA質粒是熒光素酶PGL3 質粒；細胞是肝癌細胞ifepG2。
[0042] 本發明實施例涉及一種多肽與核酸共同輸送的納米顆粒的制備方法，包括如下步 驟：
[0043] a、通過薄膜分散法制備陽離子脂質體：本實驗采用陽離子脂質（2, 3-二油氧基丙 基）三甲基氯化銨（DOTAP)與中性脂質1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)的 質量比為1 :1的氯仿溶液旋轉蒸發掉溶劑，然后水合過夜，超聲30-60分鐘。
[0044] b、利用可降解的鍵將作為多肽藥物的GGWYRQV序列與聚精氨酸（Rll)通過不同的 序列端連接起來構建Pa與Pb兩個可以不斷降解釋放多肽藥物GGWYRQV的多肽。
[0045] c、納米制劑的制備：利用上述制備好的脂質體稀釋到一定濃度（0. 04mg/mL)，與 一定濃度的多肽（〇. 16mg/mL)按質量比為1:4進行混合，其中多肽組分為PUPa或Pb中的 一種或多種的組合。再加入到核酸溶液中制備表面帶正電荷的納米顆粒，所述陽離子脂質 體、多肽和核酸的質量比為1:4:1，在常溫下孵育25-35分鐘制備三元納米顆粒。然后對應 加入適量的透明質酸鈉水溶液，并混合均勻，放置15分鐘制備四元納米顆粒。
[0046] 實施例1四元納米顆粒的制備方法
[0047] 如圖1所示，四元納米顆粒的用于測物化性質的體系在水溶液中進行。將一定量 的陽離子脂質體與多肽混合后加入到核酸水溶液中繼續混合均勻。在室溫下孵育30分鐘 制得三元納米顆粒，然后將透明質酸加入該混合物中并充分混合均勻，靜置15分鐘制得四 元納米顆粒。用于細胞實驗的載體體系用無血清培養基代替超純水即可。