一種治療系統性紅斑狼瘡的干細胞制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和再生醫學領域，具體涉及一種治療系統性紅斑狼瘡的干細 胞制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及多系統多器 官的自身免疫病，患者體內免疫系統功能紊亂，T、B淋巴細胞異常活化，產生多種自身抗體 和免疫復合物，導致患者皮膚、關節、腎臟等全身多個器官及系統受到損害。SLE好發于青年 女性，男女比例為1 :9,在我國成年女性中發病率為0. 1%，高于西方國家的0.05%，且隨著社 會經濟的發展及生活壓力的增加，SLE的發病率日益上升，由于該病病程長且反復發作，給 患者的心理和生理帶來了極大的影響。
[0003] SLE常用的治療方法主要是通過服用糖皮質激素或免疫抑制劑等藥物，以此來緩 解因免疫系統攻擊正常組織所造成的炎癥反應和抑制免疫系統的作用。雖然糖皮質激素與 免疫抑制劑被用于治療系統性紅斑狼瘡使患者的預后有了明顯改善，但是，SLE的治療現狀 仍不容樂觀：①目前仍然有約10%的患者在發病5年內死亡；②由于疾病的進展及一些治 療帶來的副作用，如出現感染、骨髓抑制、骨質疏松、高血壓、糖尿病等，尤其是細胞毒藥物 及糖皮質激素的應用，SLE患者的平均壽命明顯短于正常人群；③常規的治療方法只能減 緩病情的發展速度，非根治疾病。因此，尋找一些高效、副作用少的新治方已迫在眉睫。
[0004] 自1996年開始用自體造血干細胞（HSC)移殖治療SLE以來，在重癥難治性SLE中 取得了較好的療效，但存在易復發的問題，而異基因 HSC移殖治療SLE雖能使部分患者病 情長期緩解，但供體來源不足，病死率高達30%~50%，且治療費用高。骨髓中除了 HSC外 還存在一種形態上類似成纖維細胞的間充質干細胞（MSC)，MSC具有多向分化潛能、免疫 原性低與增殖速度快等特點。MSC不僅具有支持造血的功能，還具有免疫調節及誘導免疫 耐受的功能，研究表明MSC發揮免疫調節及誘導免疫耐受的機理主要是：抑制T細胞增殖， 使產生白細胞介素4( IL-4)的細胞數減少，產生干擾素 γ( IFN-γ)的細胞數增加，調節 Thl/Th2的平衡。MSC可通過多種途徑調節炎癥因子的釋放、誘導免疫耐受、抑制自身免疫 反應從而達到長期有效地治療SLE。但是由于單純的骨髓干細胞群體中MSC的含量極少， 如果不通過體外的進一步擴增，很難達到治療效果，且SLE是一種全身性疾病，單純的使用 MSC治療，治療效果有限，特別是對于一些重癥SLE患者來說，短期內難以達到良好的治療 效果。
[0005] 為了解決上述問題，本發明提供了一種用于治療SLE的干細胞制劑及其制備方 法，對干細胞治療SLE具有特別重要的臨床意義。
【發明內容】
[0006] 目前，SLE的治療方法主要存在的問題與缺陷：①常規治療方法副作用大、復發率 高、治療效果不佳、對難治性SLE的治療無效；②干細胞移殖作為新型療法，自體HSC移殖 復發率高；異體HSC移殖配型難、死亡率高；③成體MSC移殖是目前最有效的治療方法，其 免疫原性低，但數量有限，且由于SLE屬于全身性疾病，單純的采用MSC治療，治療效果有 限。為了解決上述問題與缺陷，本發明的目的是提供一種治療SLE的干細胞制劑及其制備 方法，彌補SLE目前的治療方法中存在的不足之處。
[0007] 本發明提供了一種用于治療系統性紅斑狼瘡的干細胞制劑中干細胞制備方法，該 方法用特殊方法誘導和培養胚胎干細胞，制備成干細胞制劑，可以有效地提高和增強干細 胞治療系統性紅斑狼瘡的療效。
[0008] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現： 一種治療系統性紅斑狼瘡的干細胞制劑的制備方法，主要包括以下步驟： (1) 胚胎干細胞的體外培養、擴增：采用胚胎干細胞的培養液將胚胎干細胞重懸后，調 整細胞密度為（1~3)X104/cm 2，接種于明膠包被的T175細胞培養瓶中，置于37°C、5%C0 2 培養箱中孵育，48小時后補液，72小時后換液。待細胞融合到85~90%時用0. 25%的胰蛋 白酶消化傳代，按照1 :3~1 :5傳代到IOOmm培養皿中，補足培養液繼續培養，每2~3d用 消化液消化傳代； (2) 誘導胚胎干細胞向間充質干細胞分化、培養、傳代和檢測：將步驟（1)中所得胚胎 干細胞的細胞濃度調整為5X IO5/皿接種到IOOmm培養皿中，每皿加入誘導體系8ml，將 培養皿置于37°C、5%C0 2進行誘導培養24h ;將經過誘導生后的干細胞更換培養液，采用 間充質干細胞培養液，待細胞長滿后用〇. 25%胰蛋白酶消化傳代，擴大培養至干細胞數為 IO8-IO9;用流式細胞儀對P3代誘導后的間充質干細胞進行鑒定：所述間充質干細胞表達 CD73、CD90、CD105 和 CD29,不表達 CD34 和 CD14 ; (3) 將步驟（2)制備的間充質干細胞與表皮生長因子（EGF)、白介素11 (IL-11)、人血 白蛋白按比例混勻，余量用生理鹽水補足，制備成干細胞制劑； 其中，所述步驟（1)中的胚胎干細胞培養液的組成為：90%DMEM培養基，10%胎牛血清、 0.1 mmol/L0-疏基乙醇、lmmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，4ng/ml重組人堿性成纖 維生長因子； 所述步驟（2)中的誘導體系為：含10%胎牛血清、100ng/mL ActivinA的去除LIF、 2mmol/L L-谷氨酰胺、10 μ mol/L Y-27632 (Rho激酶抑制劑）的DMEM (高糖）培養基； 所述步驟（2)中間充質干細胞培養液的組成為：15%胎牛血清（FBS)，85%DMEM培養液； 所述步驟（3)中干細胞制劑的具體組成為：間充質干細胞的濃度為（4~6) XlOM^/ ml，EGF為8ng/mL，人血白蛋白的質量體積比為2%，IL-Il為30ng/mL，余量為生理鹽水。
[0009] -種治療系統性紅斑狼瘡的干細胞制劑是由上述步驟制備而成的，其中由誘導后 的間充質干細胞、表皮生長因子（EGF)、人血白蛋白、白介素11 (IL-11)、生理鹽水按一定比 例配制而成； 其中，所述干細胞制劑的具體組成為：間充質干細胞的濃度為（4~6 ) X IO7個/ml，EGF 為8ng/mL，人血白蛋白的質量體積比為2%，IL-Il為30ng/mL，余量為生理鹽水。
[0010] 進一步的，所述間充質干細胞是由胚胎干細胞誘導分化而來。
[0011] 進一步的，所述胚胎干細胞是早期胚胎(原腸胚期之前）或原始性腺中分離出來的 一類細胞，它具有體外培養無限增殖、自我更新和多向分化的特性。
[0012] 本發明相對于現有技術具有以下優點和效果： (1)本發明首次將由人胚胎干細胞體外誘導培養出的間充質干細胞聯合細胞因子使 用，進行SLE的治療，治療效果顯著，從根本上提供了一種治療SLE的方法。
[0013] (2)本發明通過將間充質干細胞聯合細胞因子使用彌補SLE目前治療方法中存在 的不足之處，其中：①間充質干細胞主要具有以下幾個方面的優勢：a多向分化潛能、能分 化出多種正常細胞修復機體受損組織；b免疫原性低，大大降低了發生移植物抗宿主病的 幾率；c增殖速度快，制備容易，可以大規模產業化生產；d具有免疫調節及誘導免疫耐受的 功能，抑制T細胞增殖，調節Thl/Th2的平衡，抑制自身免疫反應從而達到長期有效地治療 SLE。②EGF的優點：EGF的存在能誘導間充質干細胞向皮膚干細胞分化，75%的SLE病人都 在臨床都表現出角質脫肩和毛囊栓、口腔潰瘍、光過敏等皮膚受損現象，皮膚干細胞一方面 可向下迀移分化為表皮基底層，進而生成毛囊；另一方面則可向上迀移，分化為各種表皮細 胞，進而修復SLE患者的受損皮膚。③IL-Il的優點：50%SLE患者出現血小板減少，IL-Il 可以減少SLE患者病人因血小板減少而引起的出血與死亡。
[0014] (3)本發明提供的干細胞制劑輸入SLE患者體內后，細胞能長期存活于患者體內， 起到了長期有效的治療作用，避免了采用常規治療方法時，患者需要長期服用各種免疫抑 制劑和激素類藥物的缺點。
[0015] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施案例并配合附圖詳細說明如 后。本發明的【具體實施方式】由以下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0016] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中： 圖1是間充質干細胞生長曲線圖，橫坐標為培養天數，縱坐標為吸光度； 圖2是狼瘡小鼠的24尿蛋白定量檢測圖，圖中分別顯示了三組小鼠 AU A2、A3隨著年 齡的增長，尿蛋白的變化情況，橫坐標為檢測時小鼠的年齡，縱坐標為尿蛋白含量； 圖3是狼瘡小鼠的體重增長記錄，圖中分別顯示了三組小鼠 AU A2、A3隨著年齡的增 長，體重的變化情況。橫坐標為檢測時小鼠的年齡，縱坐標為體重； 圖4是三組小鼠 AU A2、A3在治療前和治療后抗雙鏈DNA (dsDNA)抗體滴度測定圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面將參考附圖并結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方 式不限于此。
[0018] 實施例1胚胎干細胞的體外培養： 將液氮中保存的胚胎干細胞于37 °C水浴，快速溶化，細胞懸液由固態變為液態。采用 DMEM培養基將胚胎干細胞重懸后，調整細胞密度為（1~3) X IOVcm2，接種于明膠包被的 T175細胞培養瓶中，置于37°C、5%C0 2培養箱中孵育，48小時后補液，72小時后換液。待細 胞融合到80~90%時用％0. 25的胰蛋白酶消化傳代，按照1 :3~1 :5傳代到IOOmm培養皿 中，補足培養液繼續培養，每2~3d用消化液消化傳代。
[0019] 實施例2誘導胚胎干細胞向間充質干細胞分化 體外培養獲得胚胎干細胞的方法，同實施例1 誘導胚胎干細胞向間充質干細胞分化：將步驟（1)中所得胚胎干細胞懸液的細胞濃度 調整為5 X IO5/皿接種到IOOmm培養皿中，每皿加入誘導體系8ml，將培養皿置于37°C、5%C0 2進行誘導培養24h。所述的誘導體系為：含10%胎牛血清、100ng/mL ActivinA的去除LIF、 2mmol/L L-谷氨酰胺、10 μ mol/L