一種弓形蟲自殺性dna疫苗及構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和分子生物學技術領域，尤其是一種弓形蟲自殺性DNA疫苗及 構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲（Toxoplasmagondii)廣泛寄生于人和多種動物的有核細胞內，是一種呈 世界性分布的人獸共患寄生蟲病病原，全球約有1/3的人受感染，嚴重危害人類和動物的 健康。弓形蟲感染導致孕婦流產、畸胎或死產等嚴重后果；對于免疫抑制或免疫缺陷的病人 (如器官移植、艾滋病患者及惡性腫瘤患者），弓形蟲病是常見的致死病因之一。另外，弓形 蟲感染可引起家畜消瘦或流產，給畜牧業造成較為嚴重的經濟損失。同時，被弓形蟲感染的 家畜及其產品也成為人類感染弓形蟲主要的傳染源。然而，由于弓形蟲生活史復雜，目前還 沒有徹底的藥物來預防和治療弓形蟲的感染，臨床上常以磺胺嘧啶和乙胺嘧啶等藥物聯合 用藥來治療弓形蟲病，但療程長、毒副作用大，不能殺滅包囊。因此，免疫預防被認為是弓形 蟲防治的重要措施。
[0003]弓形蟲疫苗的研究經歷全蟲疫苗、特異組分疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。尤其 是DNA疫苗以其諸多的優勢成為當前研究的熱點，如：真核表達抗原蛋白以天然構象存在， 能刺激機體產生全身性的免疫反應；易與其他抗原聯合使用增強免疫效果；能產生持久免 疫，減少免疫次數；無需體外表達蛋白和純化，簡化疫苗制備的工序；易于大規模生產，保 存和運輸，具有良好的開發前景。然而，普通的 DNA疫苗有可能與宿主的基因組發生整合的 風險，在轉基因食品如此敏感的今天，DNA疫苗將在相當長一段時間內無法應用于畜禽的大 面積接種與防治，更很難應用于人群防疫。
[0004] "自殺性"DNA疫苗（SuicidalDNAvaccine)是近幾年提出的一種新的疫苗設計， 是在常規DNA疫苗和"自我復制型"RNA疫苗（self-r印licatingRNAvaccine)基礎上發 展起來的，不僅具有"自我復制型"RNA疫苗的安全性與有效性，而且結合了常規DNA疫苗易 制備、運輸、保存等方面的優點，堪稱近年來核酸疫苗的重大突破。用外源的抗原基因取代 甲病毒的結構基因，疫苗進入細胞后表達出甲病毒的非結構蛋白（nsPl~4)，在nsPs的作 用下使得甲病毒基因組進行高效復制，從而使插入的外源抗原基因也得到大量的表達。在 此過程中產生的大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可誘導轉染的細胞凋亡，被稱為"自 殺性"DNA疫苗。"自殺性"DNA疫苗高水平的表達，可以低劑量就刺激機體產生高水平的體 液免疫和細胞免疫應答；同時，它的"自殺性"又消除了整合到宿主基因組的風險，避免了長 期持續表達所引起的機體免疫耐受。
[0005]弓形蟲核苷三磷酸脫氫酶（nucleosidetriphosphatehydrolase，NTPase)是分 布于弓形蟲速殖子表面的一種主要特異性抗原，利用宿主細胞補救合成嘌呤途徑中不可或 缺的關鍵性酶，對蟲體在宿主細胞內的寄生和繁殖都具有重要的作用，是弓形蟲急性感染 階段引起機體產生免疫反應的主要抗原。弓形蟲NTPase蛋白有NTPase-I和NTPase-II兩 種亞型。其中NTPase-I僅存在于有毒株，而NTPase-II幾乎存在于所有弓形蟲蟲株。本 申請人曾利用重組NTPase-II蛋白免疫BALB/c小鼠后，小鼠體內產生分泌高水平IL-2與IFN-γ的Thl細胞免疫應答，該免疫應答對于弓形蟲急性感染、慢性感染均有很好的保護 力。因此，NTPase-II可作為一種弓形蟲疫苗候選抗原。
[0006] 通過檢索，發現如下幾篇與本發明專利申請相關的專利公開文獻：
[0007] 1、一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用（CN104152466A)，提 供一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1)序列表中 SEQIDNo. 1中所示的核苷酸序列；2)與1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3)對上 述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感 染預防功能的核苷酸序列。本發明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫學 上可接受的載體。本發明的質粒DNA疫苗pVAX-R0P7可有效地預防和控制弓形蟲動物模 型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒 PVAX-R0P7能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
[0008] 2、一種用于弓形蟲感染預防的疫苗及其應用（CN103330947A)，提供一種用于弓形 蟲感染預防的疫苗，包括選自以下的核苷酸序列：1)SEQIDNo. 1中所示的第736-第2385位 核苷酸序列；和/或SEQIDNo. 3中所示的第759-第2411位核苷酸序列；2)與1)中所示 的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3)對上述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。本發明的疫苗可有效地預防和控制弓形蟲動物模型 (昆明鼠）的感染，重組質粒的聯合使用可更有效地提升單基因疫苗的免疫效果。因此，質 粒PVAX-R0P5和pVAX-GRA15可作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲感染，而基于此雙基因的重 組質粒的聯合免疫可以作為雞尾酒復合疫苗用于抗弓形蟲的感染。
[0009] 3、一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用（CN103937818A)，先提供 一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1)序列表中SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列；2)與1)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3)對上 述1)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感 染預防功能的核苷酸序列。本發明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫學 上可接受的載體。本發明的質粒DNA疫苗pVAX-R0P38可有效地預防和控制弓形蟲動物模 型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒 PVAX-R0P38能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
[0010] 通過對比，本發明專利申請與上述專利公開文獻文獻存在本質的不同。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種更加安全、高效、低劑量即 可誘導強烈的免疫反應的弓形蟲自殺性DNA疫苗，其構建方法方法簡單，所構建的疫苗性 狀穩定，易于大規模生產、保存和運輸，其可以作為預防弓形蟲感染的候選疫苗。
[0012] 本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：
[0013] -種弓形蟲自殺性DNA疫苗，所述疫苗由弓形蟲NTPase-ΙI抗原基因和甲病毒復 制子載體DREP組成，所述NTPase-II是弓形蟲的核苷三磷酸水解酶，與弓形蟲的生存和繁 殖有關，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0014] -種如上所述的弓形蟲自殺性DNA疫苗的構建方法，步驟如下：
[0015]以弓形蟲RH株DNA為模板，利用一對特異性引物，PCR擴增獲得長為1815bp的 NTPase-II的編碼框序列，該序列不含信號肽，然后將純化后的NTPase-II片段插入到甲病 毒復制子載體DREP上的XmaI和SpeI位點，形成重組質粒DREP-NTPase-II，提取質粒并 純化之后，獲得弓形蟲自殺性DNA疫苗。
[0016] 而且，所述一對特異性引物序列為：
[0017]NTPase-II上游引物：SEQIDN0. 3;
[0018]NTPase-II下游引物：SEQIDNO. 4〇
[0019] 而且，具體步驟如下：
[0020] ⑴設計特異性引物：
[0021] 根據弓形蟲RH株NTPase-II基因序列，該基因序列去除信號肽，設計一對特異性 引物NTPase-II上游引物和NTPase-II下游引物，在引物5'端分別引入Xmal和Spe I酶 切位點；
[0022] ⑵NTPase-II基因擴增：
[0023] 以弓形蟲RH株DNA為模板，用KAPAHiFi高保真酶擴增NTPase-II基因，PCR反應 體系和反應條件如下：
[0024]
[0025]PCR反應條件：預變性 95°C5min，變性 98°C20s，退火 60°C15s，延伸 72°Clmin， 共32個循環，終延伸72°C2min;
[0026] 取部分PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得預期大小1815bp的目的條帶，剩余 的PCR產物純化回收，得NTPase-II片段；
[0027] ⑶NTPase-II目的片段及載體的雙酶切和回收：
[0028]NTPase-II片段和DREP-EGFP載體用Xmal和SpeI進