1β-羥基土木香內酯在制備泛素化酶抑制劑中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及1β-羥基土木香內酯在制備泛素化酶抑制 劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白的泛素化同蛋白的磷酸化一樣也是蛋白的轉錄后修飾過程，涉及細胞的 增殖、分化和凋亡等多個過程。泛素化過程是一種酶促級聯反應，首先由泛素激活酶 El(Ub-activatingenzyme)激活泛素（Ub)并將其轉移到泛素結合酶E2(Ub-conjugating enzyme)的半胱氨酸殘基上。接著形成的E2_Ub會在泛素鏈接酶E3(Ubligase)的作用下， 將Ub轉移到被修飾靶蛋白的賴氨酸殘基上。一旦Ub與目的蛋白結合后，其他的Ub也會在以 上酶促級聯反應的作用下鏈接到第一個Ub的七個賴氨酸（K6,Kll，K27,K29,K33,K48,K63) 殘基上，形成不同鏈接形式的多聚泛素鏈。此外，Ub還可通過其N端和C端首尾相連形成 直鏈泛素鏈。多聚泛素鏈依據其結合形式的不同在細胞內發揮不同的生物學功能，例如K48 泛素鏈主要是誘導目的蛋白發生蛋白酶體水解，而K63泛素鏈主要參與細胞內的信號傳導 過程。
[0003] 旋覆花屬（InulaL.)植物是菊科（Compositae)中的一屬，全世界約有100種，分 別于亞洲、歐洲和非洲，以地中海地區為主。中國有20余種，本屬多種植物常供藥用，如土 木香（I.helenium)可作為健胃、利尿、祛痰和驅蟲藥；大花旋覆花（I.britannica)具有消 痰、下氣、軟堅、行水等功效。倍半萜類化合物是本屬植物的特征性成分，以桉烷型、吉馬烷 型和愈創木烷型為主，還包括偽愈創木烷型、裂環桉烷型、欖烷型、蒼耳烷型和少量的無環 倍半萜及倍半萜二聚體。研究表明，該屬植物中的倍半萜類化合物具有驅蟲殺蟲、抗菌抗腫 瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。
[0004] 旋覆花（Inulajaponica)又名金佛花，金佛草（江浙），六月菊（河北）。多年生 草本。根狀莖短，橫走或斜生，有粗壯的須根。分布在中國北部、東北部、中部、東部、四川、 廣東等地，可供藥用。旋覆花的根及葉可治療刀傷疔毒；煎服可平喘鎮咳；其花是健胃祛痰 藥，也治療胸中痞悶、胃部膨脹、噯氣、咳嗽、嘔逆等（《江蘇省藥材志》）。旋覆花在古方為 祛痰、除濕、利腸，又為治水腫的主要藥。
[0005] 本發明人一直致力于旋覆花化學成份的系統研究，已于2011年11月29日申請 中國發明專利，專利申請號為CN201110388307.X，公開號為CN102499916A，發明名稱為 "1β-羥基土木香內酯在制備防治類風濕關節炎的藥物中的應用"，1β-羥基土木香內酯的 化學結構式如下：
[0006]
[0007] 本發明人對1β-羥基土木香內酯的藥用價值進行更深入的研究。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供1β-羥基土木香內酯的新的醫藥用途。
[0009] 本發明人對采自中國安徽亳州的旋覆花進行了系統的化學成分研究，以期明確其 化學成分，發現旋覆花的提取物1β-羥基土木香內酯對泛素化酶具有很好的抑制作用，尤 其對由TNF-α(腫瘤壞死因子α)刺激引起的NF-κΒ信號通路異常活化具有很好的抑制 作用，進一步研究發現1β-羥基土木香內酯具有較好的抗腫瘤作用。
[0010] 本發明提供了 1β-羥基土木香內酯在制備泛素化酶抑制劑中的應用。
[0011] 1β_羥基土木香內酯的化學結構式如式（I)所示：
[0012]
[0013] 所述的1β-羥基土木香內酯在制備泛素化酶抑制劑中的應用，具體是指在制備 治療由腫瘤壞死因子-ct刺激引起的細胞核轉錄因子-ΚΒ信號通路異常活化相關疾病藥 物中的應用。
[0014] 進一步地，本發明還提供了 1β-羥基土木香內酯在制備預防或治療腫瘤的藥物 或保健品中的應用。
[0015] 所述的腫瘤為肝癌等。
[0016] 本發明的應用，還可以以1β_羥基土木香內酯作為活性成分與常規藥用輔料制 成藥物制劑。
[0017] 所述的藥物制劑可以是片劑、、顆粒劑、分散片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、注射劑、 粉針劑，或氣霧劑等。
[0018] 本發明所述的1β-羥基土木香內酯是通過下列方法制備得到的：
[0019] 將干燥的旋覆花（I.japonica)的地上部分（包括莖，葉和花，采自安徽亳州）粉 粹，室溫下用95%的乙醇，分別以24,12,12小時提取3次。將所得粗提物加適量水稀釋后， 依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取。將二氯甲烷萃取物用200-300目的薄層 硅膠分離，用二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫。薄層色譜檢測，分別收集其中含有1β-羥基土 木香內酯的組分，再采用SephadexLH-20進行分離，用二氯甲烷-甲醇進行洗脫，得到混合 物，香草醛濃硫酸顯色為倍半萜類化合物，最后采用HPLC分離得到1β-羥基土木香內酯。
[0020] 本發明設計了體外包含酶的泛素化反應系統考察對1β-羥基土木香內酯對泛素 化和泛素酶活的影響。結果顯示1β-羥基土木香內酯抑制泛素化過程的機制是抑制E2_Ub 硫酯復合物的形成，提示1β-羥基土木香內酯是一種新型的E2酶抑制劑，具有重要的研究 價值。
[0021] 本發明進一步采用Pulldown和Biacore法證實了 1β-羥基土木香內酯是通過和 UbcH5c發生結合來抑制其活性的，并采用生物質譜實驗確證了 1β-羥基土木香內酯是通 過α亞甲基γ內酯環的不飽和基團與UbcH5c的Cys85發生共價結合而抑制其活性。
[0022] 本研究首次發現了 1β-羥基土木香內酯是泛素化酶UbcH5c的小分子抑制劑，并 且闡明了其作用位點和作用機制，由此我們可以得出1β_羥基土木香內酯對由TNF-α(腫 瘤壞死因子-c〇刺激引起的細胞核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路異常活化相關的疾病 如腫瘤有治療效果。本發明的1β-羥基土木香內酯具有較好的臨床應用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為1β-羥基土木香內酯對RIP泛素化的影響；
[0024] 圖2為1β-羥基土木香內酯對NEMO泛素化的影響；
[0025] 圖3為1β-羥基土木香內酯對Ubc5介導的泛素鏈形成的影響；
[0026] 圖4為1β-羥基土木香內酯對LUBAC和UbcH5c介導的直鏈泛素鏈形成的影響；
[0027] 圖5為1β-羥基土木香內酯對E2-25K(圖5A)和UbcH7 (圖5B)介導的直鏈泛素 鏈形成的影響；
[0028] 圖6為1β-羥基土木香內酯對E2_Ub復合物形成的影響；
[0029] 圖7為Pulldown法尋找1β-羥基土木香內酯結合蛋白；
[0030] 圖8為1β-羥基土木香內酯與UbcH5c結合的信號響應圖；
[0031] 圖9為1β-羥基土木香內酯與UbcH5c的計算機擬合圖。
【具體實施方式】
[0032] 現結合實施例和附圖，對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。
[0033] 本發明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0034] 實施例1 :1 β-羥基土木香內酯的制備
[0035] 將干燥的旋覆花（I.japonica)地上部分（包括莖、葉、花,采自安徽亳州）10. 0kg 粉粹，室溫（溫度25°C)下用95%的乙醇提取3次（每次100L)，每次分別用時為24,12， 12小時。將所得粗提物427. 5g加適量（10L)水稀釋后，依次用石油醚（分四次，每次40L)， 二氯甲烷（分四次，每次40L)，乙酸乙酯（分四次，每次40L)，正丁醇萃取（分四次，每次 40L)。將其中取得的二氯甲烷萃取物50. 5g用200-300目的薄層硅膠分離，用二氯甲烷-甲 醇（100:0, 50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，）進行梯度洗脫。薄層色譜檢測（2010版中國藥典 附錄VIB薄層色譜法），分別收集其中含有1β-羥基土木香內酯的組分，再采用Sephadex LH-20進行分離，用二氯甲烷-甲醇（1:1)進行洗脫，得到混合物，香草醛濃硫酸顯色為倍半 萜類化合物，該混合物采用制備HPLC分離（采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以 甲醇-水50:50為展開劑，）得到1β-羥基土木香內酯95mg(得到的化合物先采用質譜測 定分子量248,分子式C15H2(]03，再進行核磁共振分析得到碳譜、氫譜以及二維譜數據，進行結 構解析，與已知化合物1β-羥基土木香內酯的數據一致）。
[0036] 實施例2 :1β-羥基土木香內酯（IJ-5)對泛素化的影響
[0037] 除了上游的激酶可以激活IKKβ的磷酸化，近年來，越來越多的實驗證實NF-κΒ 通路的激活和泛素化密切相關。IKK除了可被ΤΑΚ1、ΜΕΚΚ3激活外，上游蛋白的泛素化對其 活化起了非常大的作用。進一步研究證明RIP1和NEMO的泛素化與NF-κΒ通路的激活有 非常密切的關系，因為這些重要信號分子的泛素化一方面介導了ΙΚΚβ與激活ΙΚΚβ的上 游激酶和下游底物（ΙκΒ)復合物的聚集，另一方面還誘導IKK復合物本身發生多聚化，進 而發生反式自磷酸化激活。
[0038] 由于RIP1發生泛素化可以募集下游的IKK復合物并誘導其激活，因此我們首先檢 測了 1β-羥基土木香內酯對轉染HA-Ub(增加檢測信號強度）293T細胞內RIP1泛素化的 影響。結果顯示1β-羥基土木香內酯在2. 5-10μΜ的劑量范圍內可以抑制TNF-α誘導的 RIP1的泛素化（圖1)。
[0039] 同樣的，當293T細胞轉染HA-ub質粒，考察1β-羥基土木香內酯對NEMO泛素化 的影響，IP結果表明1β-羥基土木香內酯在2. 5-10μΜ的劑量范圍內可以抑制TNF-a誘 導的NEMO的泛素化。（圖2)。提示1β-羥基土木香內酯是通過抑制信號通路因子的泛素 化來抑制IKK復合物的自磷酸化激活，推測1β-羥基土木香內酯可能對NF-κΒ通路中泛 素酶系統具有抑制作用。
[0040] 實施例3 :1β-羥基土木香內酯對體外泛素鏈形成的影響
[0041] 在TNF-a介導的NF-kB通路激活過程中涉及的重要的Ε2和Ε3酶分別為Ubc5和 c-IAPl。我們首先在體外構建了包含El、UbcH5c、c-IAPl和ub的泛素化反應體系，考察 1β-羥基土木香內酯對于UbcH5c介導的泛素鏈形成的影響。如圖所示（圖3)，1β-羥基 土木香內酯在2. 5-10μΜ的劑量范圍內可以劑量依賴性的抑制泛素鏈的形成，提示1β-羥 基土木香內酯可能調控