促進毛發生長的方法及其所使用的組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種毛發增生組合物，特別涉及一種促進毛發生長的方法及其所使用 的組合物。
【背景技術】
[0002] 除藥物副作用外，由于現代人的存活年齡增加，因而隨著年紀老化及生活壓力倍 增，目前越來越多人面臨局部脫發、掉發或毛發稀疏等問題，雖然毛發稀疏或脫發對于個 體的身體健康不會產生不良影響，但是，不可否認地會影響個體的外在觀感，并且據研究指 出，毛發稀疏的人較為容易導致個體情緒不佳，無法進行社交活動，可能造成個體產生社交 障礙、自信心不足、自我認同等心理問題。因此，毛發稀疏或脫發成為現代人逐漸重視的問 題。
[0003] 除通過改變洗發習慣、飲食習慣延緩毛發掉落外，目前坊間出現許多改善毛發脫 落或是促進毛發生長的產品，主要可分為兩類，其中一類為血管舒張劑，另一類為前列腺素 相關衍生物。更進一步來說，血管舒張劑中最為人所熟知的為"落健"其商業名稱為米諾 地爾（Minoxidil)(MessengerA.G.etal.，2004)，主要成分為 2,4-二胺基酸-6 哌陡基啼 P定-3-氧化物（2,4-diamin〇-6_piperidinopyrimidine3-oxide)，但是，落健并非對于所 有部分的毛發稀疏皆具有良好效果，并且，效果僅只于有使用產品時，一旦停止使用產品， 新生長出的毛發會再次脫落。而前列腺素F2a以及前列腺素E2分別被報導指出可用以促 進睫毛與頭發生長（Woodward，D.F.etal. ,2013)，不過，對于使用者造成如紅腫過敏、色素 沉淀等副作用，并且，一旦停止使用，新生長出的毛發也會脫落。
[0004] 丁烯基苯酞（butylidenephthalide，Bdph)存在于天然植物中，例如傘形科或菊 科的植物，由丙酮或氯仿萃取而得。過去研究指出丁烯基苯酞可用于治療痙攣（Ko，W.C.et al.，1980)、抗血小板凝集（Teng，C.M.etal.，1987)，并且能抑制細胞生長、促進癌細胞 死亡，例如，通過抑制端粒酶達到抑制腫瘤生長的功效（Huang,Μ.H.etal.，2014 ;Tsai， N.M.etal.，2006)、通過抑制NF-κΒ達到抑制發炎反應（Fu，R.H.etal.，2011)的功效。再 者，近期研究也發現，丁烯基苯酞通過活化Jak2/stat3信息路徑，維持胚胎干細胞的生長， 以及促進誘導型干細胞的形成（Liu，S.P.etal.，2012)。
[0005] Wnt蛋白質是高度保守（highlyconserved)的分泌性分子，為調控胚胎發育與 干細胞維持的重要因子。Wnt通過和其在細胞膜上的受體Frizzled(Frz)及LDL受體 相關蛋白質（LDL-receptor-relatedprotein,LRP5/6)結合形成三元體結構，并且作用 于細胞內的蓬亂蛋白質（Dishevelled,Dsh)。Dsh能與肝醣合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3i3，GSK_3i3)、腺瘤性結腸息肉蛋白質（adenomatouspolyposiscoli， APC)以及Axin蛋白質（axisinhibitorprotein)結合，以抑制肝醣合成酶激酶-3β的 活性，進而抑制β-鏈蛋白質（β-catenin)磷酸化，以及β-鏈蛋白質經由泛素化作用 (ubiquitination)分解的途徑。活化Wnt信息引發細胞核內β-鏈蛋白質的累積。β-鏈 蛋白質進入細胞核后，可啟動其他特殊轉錄因子，如Τ細胞因子（Tcellfactor，Tcf)，以 及淋巴增強因子（lymphoidenhancerfactor,Lef)，與Siamois等，藉此調控細胞的成長 與個體的發育。活化細胞內Wnt信息太多或不及，均會導致生物體的損害，造成早期胚胎發 育上的缺陷，或導致晚期成體中產生腫瘤或功能不全（Fodde，R.etal.，2007)。
[0006] 目前許多研究均已證實，活化Wnt可以通過刺激表皮干細胞的復制，達到促進毛 發生長的功效（Lim，X.etal.，2013)。表皮干細胞多存在于毛囊隆起區域（bulge)，為一標 志殘留細胞（label-retainingcells),平時細胞多處于休眠狀態，在表皮受損或組織需要 更新時，才會活化。Wnt/β-catenin路徑為維持表皮干細胞自我復制的重要分子，活化Wnt signal可使休眠狀態的表皮干細胞進入細胞周期，使細胞進行復制，并分化為成熟的毛發 細胞（Thompson,C.C.etal.，2006)。表現Wnt7a則可以增加毛囊再生的數目，相同地，穩 定β_鏈蛋白質而不受泛素化作用分解，提高β_鏈蛋白質于細胞核的濃度，促使新生毛囊 的產生（Gat,U.etal. ,1998)。相反地，抑制Wnt信息可以防止創傷引起的毛囊形成（Ito, Μ·etal·，2007)。
[0007] 由上可知，目前仍欠缺一種可以有效且無副作用的促進毛發生長產品，因此，開發 一種新穎且有效的毛發生長促進劑為目前最重要的研究課題。
【發明內容】
[0008] 因此，本發明的主要目的在于提供一種制備促進毛發生長的外用組合物，其能夠 減少對于人體副作用，并且達到有效促進毛發生長的功效。
[0009] 為了達成上述目的，本發明揭露式（I)化合物：
[0010]
或/及其類似物的用途，其將式（I)化合物、其類似物或上述 成分的組合用于制備促進毛發生長的外用組合物，其中，所述式（I)化合物具有活化Wnt信 號的能力。
[0011] 較佳地，所述式（I)化合物由天然植物中萃取而得，如傘形科植物、菊科植物等， 其中，所使用的萃取技術為該技術領域且具通常知識者周知。
[0012] 較佳地，所述式（I)化合物或其類似物由化學合成技術所制備而得，其中，所使用 的化學合成技術為該技術領域且具通常知識的人周知的化學合成方法。
[0013] 本發明的另一目的在于提供一種促進毛發增生的方法，其將一促進毛發生長的外 用組合物，涂抹于一個體的皮膚上，其中，該外用組合物包含一有效量的式（I)化合物：
[0014]
其類似物或上述成分的組合，以及一藥學或美容產 品上能接受的載體。
[0015] 較佳地，該皮膚為具有毛囊的區域。
[0016] 較佳地，該促進毛發生長的外用組合物直接涂抹于該個體的皮膚上。
[0017] 較佳地，該促進毛發生長的外用組合物噴灑于該個體的皮膚上。
[0018] 較佳地，該式⑴化合物的濃度為1μM-lmM。
[0019] 本發明的有益效果為：
[0020] 本發明所揭式（I)化合物具有活化Wnt信息的能力，能確實地達到促進毛發增生 的功效。本發明所揭式（I)化合物或其類似物能作為于促進毛發生長的外用組合物的活性 成分，而通過以如噴灑、涂抹等方式投予于個體特定部位的皮膚上，達到促進毛發增生，同 時提升個體外觀的功效，也能達到避免已知產品對于個體具有副作用的功效。
【附圖說明】
[0021] 圖1為各組轉染Top-flash質體DNA的細胞經不同條件培養后，偵測各組細胞的 冷光酶表現并且經統計分析出的結果。
[0022] 圖2為轉染Top-flash質體DNA或該Fop-flash質體DNA的細胞經不同條件培養 后，偵測各組細胞的冷光酶表現并且經統計分析出的結果。
[0023] 圖3為各組小鼠分別經不同處理后的外觀變化。
【具體實施方式】
[0024] 除非另有定義，本發明的說明書及權利要求書所使用的技術及科學名詞的意義， 其與本發明所屬技術領域且具通常知識者的一般理解相同。若有矛盾的情形，以本發明內 容為準。
[0025] 所謂"毛發"一詞包含個體身上各處的毛發，包含有，但不限于，頭發、體毛、睫毛、 眉毛。
[0026] 所謂"萃取" 一詞指利用物質在不同萃取劑中溶解度的差異，將混合物中特定成分 由甲相轉移到乙相中，達到分離的目的，例如溶劑萃取、超臨界萃取。一般來說，萃取劑包含 有，但不限于，丙酮、氯仿、二氧化碳。
[0027] 所謂"化學合成技術"一詞指為得到特定產物而進行的一列化學反應，如有機反 應、無機反應。
[0028] 所謂"有效量"一詞指要產生所求特定效果所需化合物或活性成分的量，可以其在 組合物中所占重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具通常知識者所了解，該有效 量會因為欲引起特定效果的投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物于組合物 中的量可占該組合物重量的約1 %至約100%，較佳為約30%至約100%。
[0029] 所謂"藥學或美容產品上能接受的載體"一詞包含任何標準于醫藥或美容產品上 所使用的載體，而該載體依據組合物的型態，可為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包 含，但不限于，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩沖生理鹽水、羊毛脂、石 蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。
[0030] 所謂"類似物"一詞包含有化合物的鹽類、其酯類、其結構異構物，如Z型結構或E 型結構，或進行結構修飾后的產物。
[0031] 本發明所揭式（I)化合物
如同【背景技術】中所述，可以 有機溶劑自傘形科或菊科植物萃取而得，如中國專利申請，申請號為20091006666. 6,或是 可以化學合成方式合成，如中國專利公告第1041725C號。由于式（I)化合物的制備為該所 屬技術領域且具通常知識者的一般知識，故在此不加以贅述。
[0032] 以下，為能更進一步說明本發明的功效，將舉若干實施例作詳細說明，這些實施例 為用以解說的例示，其中所使用的任何詞匯并不限制本發明說明書及權利要求的范圍及意 義。
[0033] 而下列實施例中所使用的式（I)化合物購于Sigma-Aldrich(W333301)。
[0034] 實施例1 :Wnt活性測試
[0035] 于六孔培養皿準備幼倉鼠腎臟纖維母細胞BHK21數量約5分滿，每孔 培養皿分別以50μL的Opti-MEM培養基（Invitrogen公司）與2μL的微脂粒 2000 (Lipofectamine2000，Invitrogen公司）于1. 5mL微量離心管混合5分鐘，形成一微 脂粒混合液。
[0036]分別將 50μL的Opti-MEM培養基與 9. 6μg的Top-flash質體DNA或Fop-flash 質體DNA混合，形成一Top-flash質體混合液及一Fop-flash質體混合液，其中，Top-flash 質體具有原生型TCF結合點（wild-typeTCFbindingsite),用以作為實驗組；Fop-flash 質體具有突變TCF結合點（mutantTCFbindingsite),控制組；而該兩種質體均接有冷光 酶（Luciferase)的序列。
[0037] 于第一測試組中，將Top-flash質體混合液加入該微脂粒混合液中，使其成為一 總體積為100μL的混合液，共有3組混合液。將各組混合液于室溫靜置反應20分鐘后，抽 出各組該混合液，分別加入培養皿中，輕搖使其均勻分布，再以Opti-MEM培養基補滿到液 面剛好覆蓋過細胞BHK21，于37°C培養4小時，而后再以Opti-MEM培養基補至每孔2mL的 培養基體積，約18~24小時后更換培養基，并且給予各組不同培養條件，其中，第一組為空 白組，第二組加入0. 4μΜ的化合物ΒΙ0,第三組加入0. 4μΜ的式（I)化合物。將各組再進 行培養約18~24小時，而后分別自各組的該培養皿中收集細胞ΒΗΚ21，偵測其冷光酶活性， 結果如圖1所示，其中，*號表示在0. 05的顯著水準之下。