一種緩釋多肽生長因子生物材料支架的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種緩釋多肽生長因子生物材料支架的制備方法。
【背景技術】
[0002]多肽生長因子是生物體胚胎發生、發育、分化以及人體各種組織損傷后再生修復過程中起重要作用的具有生物活性的多肽。人體組織損傷后的修復依賴于多肽生長因子群體的營養和支持作用。一般地說，多肽生長因子與細胞相互作用時，生長因子作為配體與相應的受體相結合形成復合體。該復合體凝聚在細胞膜表面，而后囊泡化進入細胞內，因溶酶體的存在而分解，多肽生長因子在體內半衰期極短。
[0003]多肽生長因子具有優越的生物活性，但是由于多肽生長因子在體內半衰期短，不足以在受損組織恢復過程中提供營養作用，因此直接體內注射多肽生長因子的方法并不能達到良好的治療效果，需要將多肽生長因子包封在生物高分子載體中，目前，一般是將游離的多肽生長因子通過交聯劑或者在有機溶劑中被包封到高分子材料中，使之呈緩釋狀態，以延長其作用時間。但是在制備多肽生長因子-生物高分子載體體系過程中，其制備條件、物理因素(如溫度、機械攪拌劇烈程度等)、化學因素(溶劑的pH值、緩沖液的離子強度等)以及所使用的交聯劑等會對多肽生長因子的生物活性產生一定的影響。因此如何制備一種生物材料支架，能夠為多肽生長因子提供長時程緩釋，同時最大程度上保證多肽生長因子的活性，是醫學上的一個難點。
【發明內容】
[0004]本發明的一個目的是提供一種釋放多肽生長因子的生物材料支架的制備方法。
[0005]本發明提供的釋放多肽生長因子的生物材料支架的制備方法包括如下步驟:
[0006]1)將生物材料、多肽生長因子和水混勻，反應，使所述生物材料溶脹，并且所述水以結合水、中間態水和自由水三種狀態存在于所述生物材料中，得到共混體系；
[0007]2)將所述共混體系進行冷凍處理，得到冷凍后產物；
[0008]3)將所述冷凍后產物進行冷凍恢復處理，得到釋放多肽生長因子的生物材料支架。
[0009]上述方法中，所述冷凍恢復處理就是解除冷凍狀態或者融化。
[0010]上述方法中，所述步驟1)中，所述反應的條件為0_4°C反應6_72h ；
[0011]所述步驟2)中，所述冷凍處理的條件為_80°C至_20°C處理12-48h ;
[0012]所述步驟3)中，所述冷凍恢復處理的條件為4°C處理10_24h。
[0013]上述方法中，所述步驟1)中，所述反應的條件為4°C反應48h ;
[0014]所述步驟2)中，所述冷凍處理的條件為_20°C處理24h ;
[0015]所述步驟3)中，所述冷凍恢復處理的條件為4°C處理24h。
[0016]上述方法中，所述生物材料為水凝膠類生物醫用高分子材料；所述水凝膠類生物醫用高分子材料具體為殼聚糖、聚乳酸、聚乳酸羥基乙酸、明膠或藻酸鹽。
[0017]上述方法中，所述生物材料為在水中不溶解但能夠吸水的凝膠類物質或含有羥基、羧基、氨基等親水性基團的生物醫用高分子材料。
[0018]上述方法中，所述多肽生長因子為神經生長因子、腦源性神經營養因子、神經營養素_3、神經營養素_4、神經營養素-5、神經營養素-6、神經營養素_7、堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、紅細胞生成素、膠質細胞株源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、運動神經元營養因子-1、運動神經元營養因子-2、骨形成蛋白、Nogo的抗體或硫酸軟骨素抗體。
[0019]上述方法中，所述生物材料、所述多肽生長因子和所述水的配比為l-1000mg:10_200ng: lml。
[0020]上述方法中，所述生物材料、所述多肽生長因子和所述水的配比為10mg:30ng:10ml ο
[0021]上述方法中，所述生物材料為殼聚糖；所述多肽生長因子為神經生長因子。
[0022]本發明的另一個目的是提供上述方法制備得到的釋放多肽生長因子的生物材料支架。
[0023]上述生物材料支架中，所述釋放多肽生長因子的生物材料支架的釋放時間達16周。
[0024]本發明的最后一個目的是提供上述釋放多肽生長因子的生物材料支架的新用途。
[0025]本發明提供了上述釋放多肽生長因子的生物材料支架在制備重建或修復組織或器官缺損的產品中的應用。
[0026]上述應用中，所述組織為神經組織。
[0027]本發明利用水分子作為制孔劑，先將水分子以結合水、中間態水、自由水三種狀態在溶脹過程中進入到生物材料結構網絡中；再在冷凍過程中利用水變成冰這個物理過程產生的體積膨脹使得生物材料的孔徑變大、孔隙率增高，更多的多肽生長因子得以進入到生物材料結構網絡中；最后在冷凍恢復過程中，利用冰變成水這個物理過程產生的體積收縮，使生物材料的孔徑回縮，將已經進入到材料結構網絡中的多肽生長因子包封在生物材料結構中，得到長時程緩釋神經生長因子的殼聚糖材料支架。本發明的長時程緩釋神經生長因子的殼聚糖材料支架中的多肽生長因子與生物材料之間以氫鍵連接，生物材料支架為多肽生長因子提供支撐作用，將多肽生長因子長時程緩釋出來，本發明的材料在最大程度保證多肽生長因子生物活性的同時，還能夠提供長時程的多肽生長因子緩釋，為缺損組織提供整個再生過程中生長所需的多肽生長因子。
【附圖說明】
[0028]圖1為殼聚糖材料支架反應前、冷凍后以及冷凍恢復后的表面形貌(掃描電子顯微鏡照片)。圖1Α為生物材料支架反應前的表面形貌；圖1Β為生物材料支架冷凍后的表面形貌；圖1C為生物材料冷凍恢復后的表面形貌。
[0029]圖2為殼聚糖材料支架緩釋神經生長因子的ELISA曲線。
[0030]圖3為雞胚背根神經節(DRG)在殼聚糖材料支架作用下生長的神經纖維(顯微鏡照片)。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]實施例1、一種包封神經生長因子的殼聚糖緩釋支架的制備方法
[0034]神經生長因子(NGF)是神經營養因子家族的成員之一，是最早被發現的神經營養因子，在神經元細胞存活、軸突再生以及在神經損傷之后調節施萬細胞(Schwann cell, SC)分化和軸突髓鞘再生過程都起到重要作用。中樞神經系統的軸突可以在合適的微環境下再生，可以部分恢復受損軸突的功能，但是神經生長因子在成年大鼠體內的半衰期只有7.2min。本實施例以神經生長因子為試驗對象，制備一種包封神經生長因子的殼聚糖緩釋支架，以延長的神經生長因子緩釋時間。具體步驟如下:
[0035]1、殼聚糖材料與神經生長因子共混溶脹
[0036]將10ml蒸餾水、10mg的片狀殼聚糖(圖1A)和30ng的神經生長因子混勻，得到共混體系，將其在4°C下環境下反應48小時(反應時用磁力攪拌器進行攪拌)，使殼