脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，眼角膜病變是多發病、常見病，尤其是外傷、感染局部組織病變、晶體病變會導致眼角膜邊緣改變，最終改變角膜組織的透明度導致失明。角膜病變導致的失明，目前唯一施行的治療手段是異體角膜移植，由于捐獻材料來源匱乏，大量角膜移植病例的病人因等待角膜移植而處于失明狀態。根據2011年眼科流行病學調查報告顯示:我國因角膜病變導致失明的病人約為十萬分之七點一每年，即每年增長約十萬例。目前我國每年可用于移植的異體角膜材料不足一萬只，累計等待角膜修復治療的病人數量在二百萬例左右，如果計入因部分角膜病變或邊緣角膜病變需要角膜材料或者眼表組織修復材料的病人這個數量將達到上千萬。
[0003]目前，國內外都在進行大量的角膜替代產品研究，角膜替代產品材料主要集中在異體羊膜、海洋生物膠原蛋白與異種角膜材料方面，上述材料由于材料自身特性的限制都很難達到永久性或復明性的效果。
[0004]由此可見，國內外對角膜替代品以及眼表組織修復材料的需求量大，現有的產品不具有永久性或復明性的效果，亟待進一步開發新的生物組織工程學的角膜修復材料。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法，該制備方法其拓寬了制備角膜以及眼表組織修復材料的原料來源，降低了生產角膜或眼表組織修復材料的成本，制備的脫細胞真皮基質角膜可廣泛應用于感染、外傷或組織病變導致角膜損傷的眼角膜再生性修復。
[0006]為解決上述技術問題本發明一種脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法，其包括以下步驟:
步驟A:選取哺乳動物體或人體的真皮組織；
步驟B:通過對比所述真皮組織與角膜組織的結構，確定所述真皮組織結構中與所述角膜組織結構相近且相鄰5層的真皮組織β層結構；
步驟C:去除所述真皮組織中除真皮組織β層結構以外的其他層，獲得真皮組織β層初級原料；
步驟D:對所述真皮組織β層初級原料進行脫細胞處理，獲得脫細胞真皮組織β層初級原料；
步驟Ε:將經步驟D處理的脫細胞真皮組織β層初級原料在無菌、恒溫條件下，于平衡原液中混搖一定時間，復原所述脫細胞真皮組織β層初級原料中膠原蛋白、活性因子的生物性能；
步驟F:將經步驟Ε中處理后的脫細胞真皮組織β層初級原料，在平衡液中處理，通過改變蛋白質膜的通透性和補充平衡離子的方式，封閉真皮組織β層初級原料的電位點，得到脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料。
[0007]本發明的一個實施例中，所述步驟F中，通過組合離子或者單一離子來調平所述脫細胞后的真皮組織β層初級原料的電位差，達到封閉所述脫細胞后的真皮組織β層初級原料中蛋白質的電位點的目的。
[0008]本發明的一個實施例中，所述步驟C中，去除真皮組織結構中除真皮組織β層結構以外的其他層的過程中，保留神經生長因子和巢蛋白-內功素，以利于建立細胞的非血管營養模式。
[0009]本發明的一個實施例中，所述步驟D中，移除所述真皮組織β層初級原料中具有免疫原性的表皮細胞以及其他成體細胞，保留具有天然組織立體框架的膠原蛋白和彈力纖維，并維持真皮組織β層初級原料的脫細胞前結構。
[0010]本發明的一個實施例中，所述步驟C中，利用固定液對所述真皮組織β層初級原料進行固定。
[0011]本發明的一個實施例中，所述步驟Ε中，所述恒溫條件中，溫度選擇范圍為16~37攝氏度。
[0012]本發明的一個實施例中，所述步驟Ε中，于平衡液中混搖的時間為4~24小時。
[0013]本發明的一個實施例中，所制備的脫細胞真皮基質角膜或眼表組織修復材料直接用于人或動物的移植。
[0014]本發明脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法具有以下有益效果:
本發明提供脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法中，選取動物或者人體的真皮作為原料來源，拓展了原料的來源途徑，降低了制備角膜替代材料的成本，且本發明的制備方法簡單，制造成本低，該脫細胞真皮基質角膜和眼表組織修復材料可廣泛應用于感染、外傷或組織病變導致角膜損傷的眼角膜再生性修復中。
[0015]下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明的脫細胞真皮基質角膜材料植入實驗兔隨著時間變化生長情況的顯微鏡照片圖；
圖2為本發明制備的脫細胞真皮基質角膜材料植入動物體后12小時的組織學切片照片圖；
圖3為本發明制備的脫細胞真皮基質角膜材料植入動物體后72小時的組織學切片照片圖；
圖4為本發明制備的脫細胞真皮基質角膜材料植入動物體后7天時的組織學切片照片圖；
圖5為本發明制備的脫細胞真皮基質角膜材料植入動物角膜部位6周時照片圖；
圖6為本發明制備的脫細胞真皮基質角膜材料植入動物角膜部位24周時照片圖。
【具體實施方式】
[0017]本發明脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料的制備方法，其包括以下步驟: 步驟A:選取哺乳動物體或人的真皮組織。
[0018]哺乳動物體包括豬、牛、等，較佳的，選取人體上的真皮組織，哺乳動物不同部位的真皮的功能存在差異，且不同部位真皮所含基質蛋白及各種因子的類型、數量不同。根據不同部位真皮的組成結構，功能以及各種因子含量的不同，有針對性的選擇相應部位的真皮。
[0019]步驟B:通過對比分析所述真皮組織與角膜組織的結構，確定選取真皮組織結構中與所述角膜組織結構相近且相鄰5層的真皮組織β層結構。
[0020]角膜組織結構基本可以分為5層，分別為上皮層(epitthelial layer)、前彈力層(Bowman’s membrane)、基質層(Stroma)、后彈力層(Descemet，s membrane )和內皮層(Endothelium layer)。角膜組織各層的主要成分為功能細胞和1、I1、II1、VI型膠原蛋白，膠原蛋白分層有序地排列，其中，VI型膠原蛋白以網狀結構存在，對角膜基質的有序排列也起著重要作用。直徑統一且排列規則的I型膠原蛋白是維持角膜透明的重要因素。
[0021]本發明通過電子顯微鏡對角膜結構與大量的真皮層結構進行比對、對膠原蛋白類型定性比對，膠原蛋白的排列方向順序進行比對，在250層真皮組織結構中確定了與角膜組織結構極為相近且相鄰的5層結構，本發明將該相鄰的5層結構命名為真皮組織β層結構。
[0022]步驟C:去除真皮組織結構中除真皮組織β層結構以外的其他層，獲得真皮組織β層初級原料。
[0023]在對健康真皮進行處理過程中，對真皮組織β層初級原料通過固定液進行固定，對構成框架結構的膠原蛋白和附著的生長因子等進行保護，在去除真皮組織結構中除真皮組織β層結構以外的其他層的過程中，保留神經生長因子(NGF nerve growth factor)和巢蛋白-內功素(N-E nidogen-entactin)，制備的脫細胞真皮基質角膜及眼表組織修復材料植入動物體后，可加速神經纖維的生長，快速恢復被破壞的角膜邊緣組織結構，有利于建立細胞的非血管營養模式。
[0024]步驟D:對所述真皮組織結構中的真皮組織β層初級原料進行脫細胞處理。
[0025]對真皮組織β層初級原料進行脫細胞處理，采用組織工程學和生物化學方法分離、破壞、移除真皮組織中的表皮細胞和其他成體細胞等具有免疫原性的物質，保留具有天然組織立體框架的膠原蛋白和彈力纖維等物質，并維持真皮組織β層初級原料的脫細胞前結構。
[0026]具體的，本發明利用專利號為CN1130971C中脫細胞技術中的基礎制備液，在其中加入特定酶和化學試劑制備成脫細胞及細胞外基質固定制劑，固定劑與真皮組織β層初級原料混置后進行恒溫混搖操作，對真皮組織β層初級原料進行脫細胞處理，得到脫細胞處理后的真皮組織β層初級原料。
[0027]步驟Ε:將步驟D中得到的真皮組織β層初級原料在無菌、恒溫條件下，該恒溫條件的溫度范圍為16~37攝氏度，置于平衡還原液中進行混搖操作4~24小時，復原脫細胞處理后的真皮組織β層初級原料的膠原蛋白、活性因子的生物性能。
[0028]步驟Ε中，較佳的，在溫度為25攝氏度，在平衡液中混搖操作20小時。
[0029]作為可變換的實施方式，本步驟中，在32攝氏度恒溫條件下，在平衡液中，混搖操作24小時。
[0030]作為可變換的實施方式，本步驟中，在16攝氏度條件下，在平衡液中進行混搖操作4小時。
[0031]步驟F:將步驟E中處理得到的真皮組織β層初級原料在平衡液中處理，以通過改變蛋白質膜通透性和補充平衡離子的方式，封閉真皮組織β層初級原料的電位點，使得真皮組織β層初級原料中蛋白所有電位點都為0，去除真皮組織β層初級原料中膠原蛋白電信號對細胞轉化的影響，得到可應用于人體角膜修復的脫細胞真皮基質角膜，使得脫細胞真皮基質角膜材料植入人體后，宿主細胞進入初級原料框架間隙后，其分化方向不受脫細胞真皮基質角膜材料本身的干擾。
[0032]本發明通過