一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可用于生物醫學成像領域的納米顆粒及其制備方法，具體為一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]磁性納米顆粒是近年來的研究熱點，由于其擁有均一、優異的表面物理化學性質被廣泛應用于各個行業。具有超順磁性氧化鐵納米顆粒(SP10)是未來癌癥診療的不二選擇，能夠用于診斷實驗、核磁共振造影劑、細胞分化、熱療以及藥物載帶等方面的研究。
[0003]在過去幾十年中，自下而上的合成方法被廣泛應用于磁性氧化鐵顆粒的制備。如共沉淀、熱分解、溶膠凝膠法、水熱反應等。目前基于四氧化三鐵的制備方法主要分為兩類，一類是共沉淀法，主要是在一定溫度下，將一定量的葡糖糖高聚物、鐵鹽和亞鐵鹽溶于水，攪拌下加入過量的氨水獲得粒徑約25?40納米的顆粒。但是該方法獲得的顆粒有尺寸較大，結晶度低、飽和磁化強度小，核磁共振醫學成像效果差以及包裹劑厚度不均勻等缺點。另一類是在高溫條件下，通過熱分解制備的氧化鐵納米顆粒，尺寸相對較小且更均一，磁性能優越，但是其水溶性和生理環境下穩定性差等嚴重缺陷也阻礙了其在體內成像的應用。然而，具有較大比表面積的納米顆粒容易聚集而導致磁性消失，表面活性降低，被快速從體內清除。鑒于前述的優點和缺點，制備具有高穩定、能夠避免鐵磁性聚集、在生理環境中空間結構穩定，同時具有易于化學修飾的表面基團的超順磁性金屬納米顆粒(SP10)是目前納米醫學的重大挑戰。
[0004]發展制備高質量磁性納米材料的綠色工藝，大規模可控合成磁性高、制備尺寸均勻可控、單分散性好、結晶程度高、易于表面功能化的磁性納米材料，并將其更好地應用于生物醫學領域仍是今后研究的熱點。
【發明內容】
[0005]本發明的一個主要目的在于克服上述現有技術的至少一種缺陷，提供一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，包括:將蛋白與磁性金屬鹽混合，所述磁性金屬鹽的金屬離子通過復合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產物；向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產物中加入堿，反應后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0006]根據本發明的一實施方式，所述蛋白選自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、轉鐵蛋白、膠原蛋白，以及磷脂蛋白中的一種或多種。
[0007]根據本發明的另一實施方式，所述蛋白的質量與所述磁性金屬的摩爾比為(1?100g): (0.5 ?lOOOmmol)。
[0008]根據本發明的另一實施方式，所述磁性金屬選鹽自鐵、鈷、或鎳的鹽。
[0009]根據本發明的另一實施方式，所述磁性金屬鹽選自二價鐵、三價鐵的鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽中的一種或多種。
[0010]根據本發明的另一實施方式，包括將所述蛋白的水溶液與所述磁性金屬鹽的水溶液于20?80°C混合10?60分鐘，制得所述蛋白-磁性金屬的中間分散產物。
[0011]根據本發明的另一實施方式，包括向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產物中加入所述堿，于20?90°C反應1?24小時，制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0012]根據本發明的另一實施方式，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水。
[0013]根據本發明的另一實施方式，還包括將所述蛋白-磁性金屬的中間產物與堿反應后的產物依次進行透析純化處理、離心濃縮處理或者低溫凍干處理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0014]本發明進一步提供了一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒，由上述任一項所述的方法制得。
[0015]本發明的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，所使用的原料廉價易得、天然無毒、環境友好、具有生物適用性；反應設備普通易得、制備方法簡便、綠色環保、產物無需進一步純化，適用于大規模的生產；得到的產物外包覆蛋白質、水溶性好、生物活性高、易于進一步修飾靶向分子、核磁共振醫學信號優異、尺寸超小、易于進入組織細胞內部，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內信號實時追蹤等生物醫學應用。
【附圖說明】
[0016]圖1為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的透射電子顯微鏡測試圖；
[0017]圖2為制備例1的粒徑分布圖；
[0018]圖3為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的X射線光電子能譜測試圖；
[0019]圖4為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的X射線衍射光譜譜圖；
[0020]圖5為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的磁性測試圖；
[0021]圖6為實施例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的核磁共振成像測試圖；
[0022]圖7為制備例1的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的鐵離子濃度與1/T2的線性關系圖；
[0023]圖8A為現有的未使用應用例的樣品的核磁共振醫學信號活體成像圖；
[0024]圖8B為使用了應用例的樣品的核磁共振醫學信號活體成像圖。
【具體實施方式】
[0025]體現本發明特征與優點的典型實施方式將在以下的說明中詳細敘述。應理解的是本發明能夠在不同的實施方式上具有各種的變化，其皆不脫離本發明的范圍，且其中的說明及圖示在本質上是當作說明之用，而非用以限制本發明。
[0026]本發明提供了一種水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒的制備方法，包括:將蛋白與磁性金屬鹽混合，所述磁性金屬鹽的金屬離子復合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產物；向所述蛋白-磁性金屬的中間分散產物中加入堿，反應后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。
[0027]由于本發明所制得的磁性金屬納米顆粒外面包覆有蛋白質，所以無需再進行額外的表面氨基化或是羧基化，可以直接修飾靶向分子，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內信號實時追蹤等。
[0028]本發明中，磁性金屬可以為鐵、鉆、銀、絡、猛等；蛋白可以為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、轉鐵蛋白、膠原蛋白，以及磷脂蛋白中的一種或多種。
[0029]蛋白的質量與磁性金屬的摩爾比優選為(1?100g): (0.5?lOOOmmol);所使用的磁性金屬鹽可選自二價鐵、三價鐵的鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽中的一種或多種。
[0030]在本發明的一實施方式中，將蛋白的水溶液與磁性金屬鹽的水溶液于20?80°C混合10?60分鐘，制得蛋白-磁性金屬的中間分散產物。
[0031]在本發明的另一實施方式中，向蛋白-磁性金屬的中間分散產物中加入堿，以調節溶液的pH至堿性，于20?90°C中蛋白-磁性金屬的中間分散產物反應1?24小時，制得水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。其中，堿可以為例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水。可通過加入堿，將體系的pH值調至例如10?14。
[0032]在本發明的另一實施方式中，還包括將所述蛋白-磁性金屬與堿反應后的產物依次進行透析純化處理、離心濃縮處理或者低溫凍干處理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒。例如，可將反應產物進行透析純化處理72小時，每12小時更換一次水。
[0033]本發明的制備方法所使用的原料廉價易得、天然無毒、環境友好、具有生物適用性；反應設備普通易得、制備方法簡便、綠色環保、產物無需進一步純化，適用于大規模的生產；得到的產物外包覆蛋白質，無需再進行額外的表面氨基化或是羧基化，且結晶程度高、水溶性好、生物活性高，易于進一步修飾靶向分子，核磁共振信號優異、尺寸超小、易于進入組織細胞內部，適用于活體成像、癌癥特異性靶向、以及體內信號實時追蹤等生物醫學應用。
[0034]以下，結合具體實施例對本發明的水溶性蛋白包覆的磁性納米顆粒及其制備方法做進一步說明。其中，相關的測試儀器和條件如下:
[0035]透射電鏡，將樣品水溶液稀釋為5mg/ml濃度，用移液器滴加在雙面銅網干燥后，測試。儀器為Tecnai G2F20S-TWIN，美國FEI公司，電壓:200KeV
[0036]XPS:測試儀器 Thermo Escalab 250Χ? (Thermo Scientific, China) using Mg asthe exciting source.
[0037]XRD:x射線粉末衍射儀D8Advance，德國Bruker AXS。測試角度:起始角=10，終止角=80，步寬=.01，波長=1.5406，40kV, 40mA。
[0038]弛豫率:7T小動物核磁共振成像儀(B1Spec70/20USR，Bruker)，T2-加權:RARE序列,TR:3000ms, TE:50ms。
[0039]磁滯回線:超導量子磁強計MPMS-7，測試溫度:300k，磁場0_±5T。
[0040]活體MRI成像，西門子1.5Τ臨床核磁共振成像儀。TSE序列，TR: 5520ms，TE: 120ms。
[0041]制備例1
[0042](1)將一定質量的牛血清白蛋白溶于水中，制備成20mg/mL的溶液；
[0043](2)取二價鐵和三價鐵的氯化鹽制備鐵離子混合溶液，三價鐵及二價鐵的混合摩爾比為1:2，鐵元素的總濃度為100mmol/L ；
[0044](3)在磁力攪拌條件下，將0.8mL的鐵鹽混合溶液加入到10mL蛋白質水溶液中，充分反應30分鐘，得到蛋白-鐵的中間分散產物；
[0045](4)向步驟⑶得到的蛋白-鐵的中間分散產物中加入lmL濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液，在37°C水浴中，攪拌反應8小時后停止反應。
[0046](5)將步驟(4)得到的產物進行透析純化處理72小時，使用的透析袋為截留分子量為3500，每12小時更換一次水。
[0047](6)將透析后的產物經過離心濃縮處理，得到最終的蛋白質包覆的氧化鐵納米顆粒粉末樣品。
[0048]對上述樣品進行各項表征，具體參見圖1至7。圖1為樣品的透射電子顯微鏡測試結果，表明得到的氧化鐵納米顆粒具有較小的尺寸；圖2為樣品的粒徑分布圖，顯示樣品的平均粒徑大小為4.51納米。圖3為樣品的X射線光電子能譜測試結果，在結合能為710.8電子伏的位置存在有一個明顯的峰位，表明得到的納米顆粒中鐵元素的存在形式是四氧化三鐵。圖4為樣品的X射線衍射光譜譜圖，該譜圖也表明制備的納米顆粒是四氧化三鐵的結晶形態，結晶程度良好。圖5為樣品的磁性測試圖，樣品的磁滯回線結果顯示樣品的飽和磁化強度是84.32emu每克。將樣品配制成一系列不同濃度的水溶液之后，對其進行核磁共振成像測試，結果如圖6所示，隨著樣品濃度的增加，得到的T2加權像也越來越暗，所得的結果與對應的鐵元素濃度作圖得到的結果如圖7所示，數據結果呈現良好的線性關系，表明樣品非常適用于核磁共振醫學成像應用。
[0049]制備例2
[0050](