一種用于治療肝癌的腫瘤疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤疫苗領域，具體涉及一種治療效果改進的肝癌疫苗，以及該肝癌 疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 我國原發性肝癌中90%以上為肝細胞癌（HCC)，其次為膽管細胞癌，男女發病率 比為2~5 :1。腫瘤細胞具有抗原性，能引起機體產生免疫應答，這是腫瘤免疫治療的理論 基礎。近年來，由于分子免疫學、細胞生物學和生物工程技術的發展，使腫瘤疫苗、單克隆抗 體、細胞因子、免疫活性細胞輸注及基因轉移技術等的臨床應用成為可能，使肝癌的免疫治 療研究有了巨大發展。尤其是肝癌疫苗備受關注，已成為肝癌免疫治療的研究熱點之一。運 用肝癌細胞、肝癌抗原、樹突狀細胞及核酸為基礎構建的肝癌疫苗，通過激發機體的免疫系 統，誘導機體產生針對肝癌特異性抗原的免疫應答，達到殺滅表達肝癌抗原的腫瘤細胞而 產生抗腫瘤效應的目的。通過臨床試驗發現，肝癌疫苗可以減少肝癌的復發轉移、改善患者 生存質量以及延長存活時間，已成為肝癌綜合治療的重要部分。
[0003] 雖然國內外對腫瘤疫苗的相關研究很多，但到目前為止取得突破性進展的卻不多 見，存在的主要問題有：將DNA導入到特定細胞進行表達這一技術尚不成熟，并且使用外 源DNA的安全性問題尚未解決；由于腫瘤細胞呈現高度異質性，屬于同一類型腫瘤的多個 瘤細胞上可以表達不同的抗原，由一種腫瘤抗原所激活的T細胞只能殺傷一部分的腫瘤細 胞，不表達該抗原的瘤細胞則不能被殺傷；腫瘤細胞疫苗雖然可以包含幾乎全部的腫瘤抗 原，但目前的研究表明其激活T細胞的作用有限，將其作為疫苗的效果并不理想。因此，如 何提供一種腫瘤疫苗，不存在使用安全性問題并且能對幾乎全部的腫瘤抗原有效，成為有 待解決的問題。
[0004] Exosomes是一類起源于內吞體系統并被排出于細胞外、直徑在40-100nm之間的 雙層膜性囊泡。Exosomes可以由包括樹突狀細胞、腫瘤細胞等在內的多種細胞分泌，含有大 量與其來源和功能密切相關的蛋白質和脂質成分，作為細胞間傳遞信息的重要載體，參與 多種病理生理過程。腫瘤細胞來源的exosomes含有腫瘤共同抗原、熱體克蛋白等重要的免 疫分子，可通過多種途徑表現出抗腫瘤作用，且其作為一種新型的腫瘤疫苗，較DC疫苗有 明顯的優勢。
[0005] 然而，近年來卻有一些相關實驗顯示，一些腫瘤來源的exosomes可以抑制甚至是 破壞在腫瘤中發揮作用的免疫細胞，比如下調一些NK受體的表達，影響到腫瘤免疫中一些 固有免疫細胞的激活，還有的可以顯著抑制IL-2從而抑制人類淋巴細胞的增殖，因而在腫 瘤的免疫治療中起到一些負面作用。這些由腫瘤來源的exosomes可能就是腫瘤組織逃逸 機體免疫系統清除的關鍵因素，給腫瘤的免疫治療帶來很多困難和挑戰。因此，如何提高腫 瘤細胞來源exosomes的免疫刺激能力，而減少它的免疫抑制能力在腫瘤的免疫治療中有 重大的實際意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種對淋巴細胞增殖功能沒有抑制作用的肝癌疫苗。
[0007] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0008] -種治療效果改進的肝癌疫苗，包括肝癌細胞分泌的exosomes小體，所述的肝癌 細胞是經過Cephaloziellins J和SAHA聯合加藥處理的，Cephaloziellins J和SAHA的 摩爾濃度之比為0. 8~1. 2:1。
[0009] 進一步地，Cephaloziellins J和SAHA的摩爾濃度之比為1: 1。
[0010] 進一步地，所述的治療效果改進的肝癌疫苗還包括佐劑。
[0011] 進一步地，所述佐劑為為鋁佐劑。
[0012] 所述的肝癌疫苗的制備方法，包括如下步驟：肝癌細胞用含胎牛血清的DMEI培養 液在C0J?箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，每3~4天傳代1次，待細胞生長至對數期時 接種；接種24h后，用C印haloziellins J和SAHA加藥處理細胞，繼續培養24h后收集培養 上清液，低溫保存；將收集到的肝癌細胞培養上清液離心去除細胞，取上清液；再離心去除 細胞碎片，收集上清液，濃縮超濾，離心得到濃縮液，將分離純化的濃縮液移至離心管中，低 溫條件下超速離心，所得沉淀即含有exosomes小體。
[0013] 進一步地，所述的制備方法包括如下步驟：肝癌細胞用含100ml/L胎牛血清 的DMEI培養液，在37°C 50ml/L C02孵箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，每3~4天傳 代1次，待細胞生長至對數期時按3 X 106/100ml接種；接種24h后用1 X 10 6mol/L的 C印halozie 11 ins J和1 X 10 6mo 1/L的SAHA處理細胞，繼續培養24h后收集培養上清 液，4°C保存；將收集到的肝癌細胞培養上清液300g離心10min去除細胞，取上清液；再以 1500g離心30min去除細胞碎片，收集上清液，通過100kU MffCO Centriplus離心超濾管濃 縮超濾，以1500g離心30min得到濃縮液，將分離純化的濃縮液移至離心管中，4°C條件下用 水平轉角以l〇〇kg超速離心60min，所得沉淀即含有exosomes小體。
[0014] 所述的肝癌疫苗在制備抗肝癌的藥物中應用。
[0015] 本發明的優點：已知未經處理的肝癌細胞分泌的納米級小囊泡exosomes及 其可溶性免疫分子對淋巴細胞增殖功能具有顯著的抑制作用。本發明創造性地使 用Cephaloziellins J和SAHA加藥處理肝癌細胞，結果表明，處理后的肝癌細胞分泌 的exosomes及其可溶性免疫分子則能顯著改善前述的抑制作用。本發明顯著提高了 exosomes腫瘤疫苗治療效果，具有重要的臨床應用價值。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。實施 例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如教科書和實驗指南中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。Cephaloziellins J的化學結構和制備方法參見文獻： Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri? J. Nat. Prod. ，2013,76,1700-1708。
[0017] 實施例1 :細胞培養
[0018] 實驗材料：H22-H8D8細胞株、10%胎牛血清、青鏈霉素混合液（北京泰格美公司）。
[0019] 實驗方法：將1122-!1808細胞株培養于含10%胎牛血清、青霉素10011]/1^、鏈 霉素100X yg/mL的DMEI培養液中，37°C 5% C0J?箱中培養，待生長至對數期時，按 3 X 106/100ml 接種。
[0020] 實施例2 :藥物處理
[0021] 實驗材料：Cephaloziellins J 自制，制備方法同文獻（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat. Prod·，2013,76， 1700-1708)，經鑒定為 Cephaloziellins J;SAHA 購自 sigma 公司。
[0022] 實驗分組：細胞培養液體積每組嚴格一致，空白對照組、exosomes對照組（不加 藥組）、exosomes 實驗組 1 (加藥 Cephaloziellins J)、exosomes 實驗組 2 (加藥 SAHA)、 exosomes 實驗組 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 聯合加藥）。
[0023] 實驗方法：對照組，接種后不加藥物，24h后收集上清液150ml作為對照；加藥組 1，接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J處理，在加藥24h后收集培養上清 液150ml ;加藥組2,接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養 上清液 150ml ;加藥組 3,接種 24h 后用 1 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養上清液150ml，并4°C保存。
[0024] 實施例3 :藥物處理
[0025] 實驗材料：Cephaloziellins J 自制，制備方法同文獻（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat. Prod·，2013,76， 1700-1708)，經鑒定為 Cephaloziellins J;SAHA 購自 sigma 公司。
[0026] 實驗分組：細胞培養液體積每組嚴格一致，空白對照組、exosomes對照組（不加 藥組）、exosomes 實驗組 1 (加藥 Cephaloziellins J)、exosomes 實驗組 2 (加藥 SAHA)、 exosomes 實驗組 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 聯合加藥）。
[0027] 實驗方法：對照組，接種后不加藥物，24h后收集上清液150ml作為對照；加藥組 1，接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J處理，在加藥24h后收集培養上清 液150ml ;加藥組2,接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養上 清液 150ml ;加藥組 3,接種 24h 后用 0· 8 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養上清液150ml，并4°C保存。
[0028] 實施例4 :藥物處理
[0029] 實驗材料：Cephaloziellins J 自制，制備方法同文獻（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri, J.Nat. Prod. ,2013,76, 1700-1708)，經鑒定為 Cephaloziellins J;SAHA 購自 sigma 公司。
[0030] 實驗分組：細胞培養液體積每組嚴格一致，空白對照組、exosomes對照組（不加 藥組）、exosomes 實驗組 1 (加藥 Cephaloziellins J)、exosomes 實驗組 2 (加藥 SAHA)、 exosomes 實驗組 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 聯合加藥）。
[0031] 實驗方法：對照組，接種后不加藥物，24h后收集上清液150ml作為對照；加藥組 1，接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J處理，在加藥24h后收集培養上清 液150ml ;加藥組2,接種24h后用濃度1 X 10 6mol/L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養上 清液 150ml ;加藥組 3,接種 24h 后用 1. 2 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA處理，在加藥24h后收集培養上清液150ml，并4°C保存。
[0032] 實施例5 :exosomes的分離與純化