一種歐洲越橘提取物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物提取物，具體是一種歐洲越橘提取物及制備這種提取物的方 法。
【背景技術】
[0002] BV :樹脂柱體積
[0003] DVB :二乙烯苯
[0004] 總花色苷：是15種花色苷的混合物，它們分別是：
[0005] 1.氯化飛燕草素-3-0-半乳糖苷，英文名稱delphinidin-3-O-galactoside chloride
[0006] 2.氯化飛燕草素-3-0-葡萄糖苷，英文名稱delphinidin-3-〇-glucoside chloride
[0007] 3.氯化矢車菊素-3_〇-半乳糖苷，英文名稱cyanidin_3-〇-galactodise chloride
[0008] 4.氯化飛燕草素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名稱delphinidin_3-〇-arabinoside chloride
[0009] 5.氯化矢車菊素-3-0-葡萄糖苷，英文名稱 cyanidin_3-〇-glucoside chloride
[0010] 6.氯化矮牽牛素-3-0-半乳糖苷，英文名稱petunidin-3-〇-galactoside chloride
[0011] 7.氯化矢車菊素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名稱cyanidin-3-〇-arabinoside chloride
[0012] 8.氯化矮牽牛素-3_〇-葡萄糖苷，英文名稱 petunidin_3-〇-glucoside chloride
[0013] 9.氯化巧藥素-3_〇-半乳糖苷，英文名稱 peonidin_3-〇-galactoside chloride
[0014] 10.氯化矮牽牛素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名稱petunidin_3-〇-arabinoside chloride
[0015] 11.氯化巧藥素-3-0-葡萄糖苷，英文名稱 peonidin_3-〇-glucoside chloride
[0016] 12.氛化錦奏素-3_〇-半乳糖音，英文名稱 malvidin_3-〇-galacoside chloride
[0017] 13.氯化巧藥素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名稱peonidin_3-〇-arabinoside chloride
[0018] 14.氯化錦葵素-3-0-葡萄糖苷，英文名稱 malvidin_3-〇-glucoside chloride
[0019] 15.氯化錦葵素-3-0-阿拉伯糖苷，英文名稱 malvidin-3-〇_arabinoside Jiloride
[0020] AB-8和D101天津南開和成科技有限公司，
[0021] XAD-7HP陶氏化學公司，
[0022] HPD100滄州寶恩吸附材料科技有限公司
[0023] 上柱液：以歐洲越橘果或市售總花色苷含量36%歐洲越橘提取物為原料，制備含 總花色苷濃度為1. 5-5. 5mg/ml的酸性水溶液，該酸性水溶液在此定義為上柱液。
[0024] 歐洲越橘提取物（Bilberry Extract)是以成熟的歐洲越橘（Vaccinium myrtillus)漿果為原料，經提取、純化得到的植物提取物，已載入歐洲藥典（EP)植物藥及 制法專論部分（Monographs on Herbal Drugs and Herbal drug preparations)，并作為膳食 補充劑（Dietary Supplments)載入美國藥典（USP)。因其所含的花色苷類成分具有抗氧化、 清除自由基等生理活性，歐洲越橘提取物主要應用于功能性食品及醫藥工業中。EP及USP 中均對歐洲越橘提取物中總花色苷含量做出了規定。EP中規定，以高效液相色譜法（HPLC) 檢測，以氯代矢車菊素-3-0-葡萄糖苷計，總花色苷含量在32. 4 %至39. 6 %范圍內。USP規 定總花色苷含量不低于36%。
[0025] 花色苷分子由苷元（即花色素）及糖配基兩部分組成。花色素是具有黃酮類化合 物C6-C3_C6結構的，2-苯基苯并吡喃的多羥基和甲基衍生物，以0-糖苷鍵與糖配基連接。 由于黃烊鹽陽離子缺乏電子，游離的花色素很不穩定。在歐洲越橘提取物制備過程中，應盡 力避免糖配基的丟失，從而影響其穩定性。EP及USP均規定以氯代矢車菊素計總花色素含 量低于1% (HPLC)。
[0026] 現有文獻報道中，存在于歐洲越橘中的花色苷苷元主要有五種，與3種糖配基形 成15種花色苷。不同花色苷生理活性上存在差異。各花色苷的比例是歐洲越橘提取物生 理活性的影響因素之一。EP中給出了這15種花色苷的HPLC指紋圖譜，并作出了相關規定。
[0027] 目前，市售歐洲越橘提取物規格多為總花色苷含量36% (HPLC)，即符合USP規定， 未見指紋圖譜符合歐洲藥典規定，且總花色苷含量更高的產品報道。現有工業化制備歐洲 越橘提取物工藝的基本流程是：以酸化醇水溶液自歐洲越橘果中提取總花色苷，經回收溶 劑、濃縮的提取液通入大孔吸附樹脂進行吸附。吸附結束后，水洗，以適當解吸劑對吸附于 樹脂上的花色苷進行洗脫。洗脫液回收溶劑，濃縮，干燥，得到產品。其中大孔吸附樹脂純 化步驟決定產品中總花色苷含量。
[0028] 目前找到的和本發明的制備方法最為接近的現有技術為CN102240316B，其中針對 花色苷的熱敏性，使用納濾膜濃縮方法避免了回收溶劑、濃縮過程中加熱造成的花色苷分 解。所制備的越橘提取物中花色苷含量未高于40%。該方法采用納膜濃縮最大的缺陷就是 納膜非常容易堵塞，需要頻繁的清洗更換納膜，不適于大規模的工業化生產。
[0029] 另一篇對比文獻CN103467545A公開了一種從歐洲越橘中提取花色苷的方法。 歐洲越橘以酸性乙醇水溶液提取，提取液濃縮后，通入D101大孔吸附樹脂柱，水洗，以 40-60%乙醇水溶液洗脫花色苷。洗脫液濃縮、干燥后所得粗提物。截止到粗提物這一步基 本與CN102240316B的技術方案相似，得到粗提物后又以丙酮進行亞臨界萃取。這篇對比文 件中盡管總花色苷含量約為70%，但是所得成品收率僅為0. 5%，并且亞臨界萃取需在密 閉、無氧、低壓的壓力容器內進行，對設備要求高，生產成本高，工藝復雜。此外，此發明并未 明確描述總花色苷檢測方法、含量測定基準物、以及指紋圖譜，無法獲知其產品質量監控的 所有條件。
[0030] 近年來由于花色苷具有增強免疫系統功能，預防心血管疾病，預防癌癥，抑制腫瘤 細胞生長，預防關節炎、腫脹等炎癥，緩解過敏癥，增強動脈、靜脈及毛細血管彈性等眾多生 理功能而備受關注。但是卻缺少為諸多研究提供1?濃度的花色昔的物質基礎，得到1?濃度 總花色苷的方法尚且如此困難，從中分離高濃度的單體更是難上加難，因此亟需一種高濃 度的總花色苷作為藥理、臨床、以及進一步分離提純單體作為研究的物質基礎；當然要想得 到這樣高濃度花色苷首先需要建立一種簡單、高效的花色苷提取物制備方法、檢測方法作 為技術支持。當然這些研究開發對歐洲越橘提取物進一步的成分開發、利用也具有十分重 要社會價值和經濟價值。
【發明內容】
[0031] 本申請發明人通過創造性的勞動發現，在用大孔吸附樹脂提取歐洲越橘物的現有 方法中，大孔吸附樹脂內部結構是制備高純度花色苷方法中關鍵中的關鍵步驟，換句話說， 只要選對大孔吸附樹脂的結構，并控制好大孔吸附樹脂的投料比就攻克了該方法的最核心 部分；其次關鍵步驟還包括解析劑所用酸醇的比例。該方法不僅不需要像CN103467545A那 樣對上柱液先濃縮，更不需要對得到的提取物進行像CN102240316B那樣的濃縮處理，就能 夠達到總花色苷的含量高達95%，且收率為大于60%。本發明另一個顯著地有益效果體現 在沒有放大效應，適于大工業生產，是目前工藝步驟最為簡便、成本最為低廉的方法。更具 體的本發明體現在以下兩個方面：
[0032] 首先，本發明提供了一種總花色苷含量55% -95%的歐洲越橘提取物，并提供了 該提取物的鑒定以及監控方法：歐洲越橘提取物為紫黑色，具有越橘特殊氣味的均勻無定 形粉末。以歐洲藥典規定的高效液相色譜方法檢測，以干物計，總花色苷含量在55%至 95%范圍內，總花色素含量不高于1%。HPLC指紋圖譜符合歐洲藥典要求。
[0033] 其次，本發明提供了一種制備總花色苷含量在55% -95%的歐洲越橘提取物的方 法，的目的通過下述的技術方案實現：
[0034] 制備方法是以歐洲越橘果或市售總花色苷含量36%歐洲越橘提取物為原料，制備 含有越橘總花色苷的酸性水溶液，以大孔吸附樹脂吸附其中花色苷，酸水洗后，酸性乙醇水 溶液解吸花色苷，解吸液濃縮、噴霧干燥，即得產品。制備過程中總花色苷保留率，即收率 聞于80 %。
[0035] 本發明提供的歐洲越橘提取物制備方法包括的步驟：
[0036] 1)以歐洲越橘果或市售總花色苷含量36%歐洲越橘提取物為原料，制備含總花 色苷濃度為1. 5-5. 5mg/ml的酸性水溶液，該酸性水溶液又稱為上柱液。
[0037] 2)上柱液通入經預處理的大孔吸附樹脂柱，進行吸附。吸附結束后，以酸性水洗至 流出液澄清，再以乙醇、或者甲醇或者丙酮酸性水溶液為解吸劑，進行解吸，分部接受洗脫 液合并其中總花色苷含量為55% -95%的部分，濃縮，噴霧干燥，即得成品。
[0038] 上述技術方案中：
[0039] 步驟1)中如以歐洲越橘果為原料，以如下步驟制備酸性水溶液：
[0040] 以組織勻漿機將歐洲越橘果破碎為果漿。以2-5倍果漿質量的、體積分數為 30-80%的、并以鹽酸調pH值2-3的乙醇水溶液，于40-60°C加熱回流提取2-3次，過濾，濾 液合并，回收乙醇，濃縮。優選的提取溶劑體積分數為60%，并以鹽酸調pH值為2的乙醇水 溶液，用量為果漿質量的3倍，于50°C加熱回流提取2次。
[0041] 步驟1)中如以市售總花色苷含量36%的歐洲越橘提取物為原料，稱取提取物，加 水攪拌溶解，配制提取物濃度為5-15mg/ml的溶液，并以鹽酸調pH值至酸性，優選pH在2-5 范圍內。
[0042] 步驟2)中所用大孔吸附樹脂為以聚苯乙烯為主要骨架自制大孔吸附樹脂。
[0043] 自制大孔吸附樹脂可由以下步驟制備：
[0044] a)將聚乙烯醇和氯化鈉配制為水溶液，作為懸浮聚合水相；
[0045] b)將質量純度為55-80 %的二乙烯苯（DVB)與酯類單體依投料比混合，加入致孔 劑、引發劑，混合均勻后，為懸浮聚合油相；
[0046] c)將a)制得水相加熱至30_50°C，將b)制得的油相加入上述水相中，在攪拌下 65-75°C下反應4-6小時，升溫至80-85°C繼續反應2-3小時，經過濾，依次以熱水、乙醇洗 滌，干燥，即得成品。
[0047] 在自制大孔吸附樹脂的技術方案中：
[0048] 步騾a)中水相中聚乙烯醇質量濃度為0. 5-1. 5%，氯化鈉水溶液質量濃度為5%。
[0049] 步驟b)中酯類單體為二甲基丙烯酸乙二醇酯，或者丙烯酸甲酯，或者甲基丙烯酸 甲酯中的一種或幾種；
[0050] DVB與酯類單體投料比為19 : 1-7 : 3,優選的為9-4 : 1 ;
[0051] 致孔劑為甲苯、或200#汽油、或環己烷、或甲基環己烷中的一種或幾種，優選的為 甲苯、200#汽油混合物，兩者質量比為4-1 : 1;致孔劑加入量為DVB與酯類單體質量總和 的 100-200% ;
[0052] 引發劑為偶氮二異丁腈或過氧化苯甲酰，加入量為DVB及酯類單體質量和的 1-2%。
[0053] 步驟c)中水相與油相的體積比為2. 5-4 : 1。
[0054] 步驟2)中大孔吸附樹脂柱柱徑比為3-10 : 1。
[0055] 步驟