一種抗禽流感病毒轉移因子制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及獸用生物制品技術領域，具體涉及一種抗禽流感病毒轉移因子制備方法。
【背景技術】
[0002]禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的一種急性傳染病，也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病。人感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為33 %。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播，區域間的人員和車輛往來是傳播本病的重要途徑。
[0003]轉移因子(Transfer factor, TF)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的可透析小分子物質-多肽核苷酸復合物，它能夠特異地將供體的細胞免疫信息轉移給受體正常的淋巴細胞，從而增強受體的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非細菌性感染，也可以通過白介素與干擾素作用于免疫應答過程。畜禽脾臟為加工過程中的廢物，因此有著極大的應用前景，已成為轉移因子的研究熱點。
[0004]轉移因子含多種成分，分子量小于10000，無熱原，無抗原性，無毒副作用，是一種新型而又安全的免疫制劑。轉移因子不會被胃蛋白酶、胰蛋白酶分解，也不會被胃酸破壞，可以口服，使用劑量小，起效快，藥效持續時間長。轉移因子作為具有特異性與非特異性的免疫活性細胞調節因子，可以用于動物病毒性疾病、真菌感染、細胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤的輔助治療。目前，常規的制備方法主要是離心、超濾等，容易影響轉移因子的活力、回收率低、純度低。因此，需要一種快速、高效并且成本較低的從動物脾臟中獲取轉移因子的方法，以滿足目前的工業化生產。
【發明內容】
[0005]本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種抗禽流感病毒轉移因子制備方法。以解決現有技術中相關方法所制備的轉移因子活力較低的技術問題。
[0006]本發明要解決的另一技術問題是有技術中相關方法收率較低。
[0007]為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案:
[0008]—種抗禽流感病毒轉移因子制備方法，包括以下步驟進行:
[0009]1)原材料的制備:取6月齡豬，用禽流感病毒疫苗皮下注射免疫，2周后，再以同樣方法及劑量免疫一次；二次免疫后15-20天取豬脾臟；
[0010]2)預處理:去除豬脾臟的筋膜和脂肪組織，洗凈；
[0011]3)破碎:將步驟2)預處理后的豬脾臟剪碎，加入3倍體積的預冷磷酸鹽緩沖溶液，用高速組織搗碎機以1000r/min?2000r/min搗碎3?5次，每次5min，制得勻漿液；
[0012]4)凍融:將步驟3)所得勻漿液置于_80°C冷凍，而后在22°C?37°C水浴條件下融化，交替凍融5?10次；
[0013]5)高壓勻漿:向其中加入表面活性劑，利用高壓均質機在60MPa條件下進行細胞破碎；
[0014]6)提取:向其中加入2?5倍體積的預冷磷酸鹽緩沖液，4°C條件下以6500?8000r/min速率離心lOmin，取上清；
[0015]7)凝膠色譜分離:將步驟6)所述上清通過微孔濾膜過濾，而后利用凝膠色譜柱分離，收取6000道爾頓以下的物質，即為粗產物；
[0016]8)透析:將步驟7)所得粗產物裝入透析袋，于4°C條件下現在0.05M PBS溶液中透析8h?18h，再置于0.01MPBS溶液中透析8h?18h，所得產物即為抗禽流感病毒轉移因子。
[0017]優選的，步驟7)所述微孔濾膜的孔徑為0.45 μm0
[0018]優選的，步驟5)所述表面活性劑是聚山梨酯。
[0019]優選的，還包括步驟9):將透析后的產物用孔徑為0.22 μ m的濾膜加壓過濾除菌。
[0020]優選的，所述抗禽流感病毒轉移因子密封保存于4°C條件下。
[0021 ] 在以上技術方案中，破壁之前加入表面活性物質，益于破壁，且更徹底；采用先免疫后提取的方法，用禽流感病毒免疫豬，以豬脾臟為原料，得到特異性抗禽流感病毒轉移因子。本發明采用了低溫反復凍融、化學方法降低細胞膜的穩定性、高壓勻漿法、凝膠色譜分離、透析等方法，所得到的目的產物產出率高、純度好、特異性強，且可制備成口服液或者片劑等，便于應用。
[0022]本發明的技術優勢主要體現在以下方面:
[0023](1)原材料來源容易，無污染，價廉等優點。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料，為廢棄物。
[0024](2)本工藝采用先免疫后提取的方法，免疫后在抗體水平最高期宰殺，取脾臟、胸腺等，最終得到特異性抗禽流感病毒轉移因子。
[0025](3)在提取轉移因子過程中用低溫凍融處理，不使小分子物質活性喪失，并能夠使禽流感病毒轉移因子得以充分的提取。
[0026](4)高壓勻漿前加入表面活性物質，可以影響細胞膜的通透性，進而使得裂解更徹底。
[0027](5)本發明使用凝膠色譜過濾，所得到的轉移因子提取物經體外活性試驗及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、免疫活性起效快而維持時間長、易吸收、無不良反應等特點。
[0028](6)提高了轉移因子的生產效率，進而降低了成本，傳統的提取方法是通過反復凍融和離心透析，生產的轉移因子原液，每1kg脾臟約生產含量為2.0g/L的原液2L，而采用本發明生產，每1kg脾臟約生產含量為8.5g/L的原液1L，折合產量增加112.5%
[0029](7)轉移因子提取物經體外生物活性試驗及本產品是一種不含蛋白質、只含可溶性的小分子物質，分子量在6000道爾頓以下。該提取物可做成各種劑型，如口服劑型、糖漿劑型等，還可通過常規凍干工藝進一步可得到抗禽流感病毒轉移因子的粉末，結合常規輔料，可制成膠囊、片劑等劑型。
【具體實施方式】
[0030]以下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0031]以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數值不限于該準確數值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數值在正負百分之十(10%)的范圍內變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數值。此外，在“大約第一數值到第二數值”的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0032]除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0033]以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0034]實施例1
[0035]1、轉移因子的制備
[0036](1)用預冷超純水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪組織，精確稱量1kg，再用預冷超純水洗滌干凈。
[0037](2)將洗干凈的豬脾臟用絞肉機初絞3次，加入3倍體積的預冷磷酸鹽緩沖溶液，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次，每次5min，制得勾楽液。
[0038](3)將勻漿液置于_80°C快速冷凍，水浴30°C中融化，交替凍融5次。
[0039](4)向凍融好的勻漿液中加入1 %的表面活性劑，于高壓勻漿機內，壓力60MPa進行均質，制成勻漿。
[0040](5)向勻漿中加入3倍體積的預冷磷酸鹽緩沖液，置于冰凍離心機于4°C以7000r/min, lOmin，取上清。
[0041 ] (6)將上清液通過0.45 μ m的微孔濾膜，流經凝膠色譜柱，進行分離，收取6000道爾頓以下的小分子物質。
[0042](7)將上述粗分離產物經透析袋(500道爾頓)，4°C于0.05M PBS中透析12h，再置于0.01MPBS溶液中透析12h。
[0043](8)除菌:將超濾