一種殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學組織工程復合材料制備技術領域，具體涉及一種殼聚糖/氧化石墨稀/納米輕基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法。
【背景技術】
[0002]由于創傷、感染、腫瘤、骨髓炎以及各種先天性疾病等原因所造成的骨缺損是目前國內外臨床醫學中最常見、最棘手的困難之一，而骨組織工程在修復骨組織病變或缺損方面具有獨特的優勢。其基本思路是將種子細胞種植在具有一定生物活性并在人體內可逐漸降解吸收的支架材料上，經體外培養形成細胞生物材料復合物，然后將復合物植入人體的骨組織缺損部位，在細胞不斷增殖并分泌基質的同時，支架材料逐漸降解被人體吸收，最終形成新的具有與原功能和形態相似的骨組織。在骨組織工程三要素:種子細胞、生長因子、支架材料中，支架材料起著至關重要的作用，它不僅將種子細胞和生長因子運送到骨缺損部位，而且還給新骨組織提供支撐作用。理想的骨支架材料應具備以下幾點:(1)具有良好的生物相容性、生物可降解吸收性以及能承載并釋放有利于細胞和組織生長的藥物及生物活性物質；(2)具有三維連通的多孔結構，有利于細胞的生長及代謝產物和營養物質的交換；(3)具有足夠的力學性能，與機體組織具有良好的生物機械適應性。目前，模仿天然骨的成分，骨修復支架材料通常是由無機相和有機相組成的。
[0003]在生物相容性好的有機材料中，殼聚糖(CS)作為天然的高分子材料，具有良好的生物相容性和生物活性，其多糖骨架結構以及其獨特的化學性質，有利于細胞的粘附和增殖，因而被廣泛用于組織工程領域。羥基磷灰石是人體骨骼組織的主要無機組成成分，具有優良的生物活性和骨傳導性能，納米羥基磷灰石(nHA)具有更好的理化性能，可提供對細胞在細胞質基質中粘附、生長和分化的生物刺激信號。然而，提高殼聚糖/納米羥基磷灰石復合支架材料的生物力學性能，滿足臨床應用中應力集中部位骨缺損修復的要求，仍是一個巨大的挑戰。
[0004]石墨烯具有優異的力學性能、大的比表面積和良好的生物相容性，因而在生物醫學領域擁有巨大的應用潛力。氧化石墨烯(G0)是石墨烯的衍生物，其表面含有大量的含氧官能團，能與殼聚糖進行共價交聯反應生成界面相互作用更強的共價鍵，因而可改善支架的機械性能。研究還表明，氧化石墨烯能促進骨髓間充質干細胞的生長和分化。然而，氧化石墨烯表面含有多種不同的含氧官能團，如羰基、羥基、環氧基和羧基等，嚴重影響了氧化石墨烯與殼聚糖等高分子材料的交聯穩定性，導致支架材料的力學性能下降。
[0005]本發明提出利用羧基化改性的氧化石墨烯與混有納米羥基磷灰石的殼聚糖溶液進行共價交聯反應，制備殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石(CS/cGO/nHA)三維多孔復合生物支架，通過提高氧化石墨烯表面羧基官能團的含量，提高復合支架的力學性能和生物活性，進而實現復合多孔支架材料在骨組織工程中的應用。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，該支架材料具有高度連通的三維多孔結構、優良的力學性能和生物活性，可作為細胞培養支架用于骨組織損傷修復。
[0007]本發明的目的可通過以下技術方案來實現:一種殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008](1)按羧基化氧化石墨稀、水(超純水)的配比為1.5-30mg:10mg，稱取羧基化氧化石墨烯加入水(超純水)中，超聲分散配制成羧基化氧化石墨烯水溶液；按羧基化氧化石墨烯:交聯劑EDC:交聯劑NHS的配比為1.5-30mg:19.7-59.lmg:23.0-69.0mg，取交聯劑EDC和交聯劑NHS加入到分散均勻的羧基化氧化石墨烯溶液中，室溫下磁力攪拌lh，活化羧基，得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；
[0009](2)按羥基磷灰石、稀醋酸溶液的配比為15-60mg:10mL,將羥基磷灰石加入到稀醋酸溶液中，經超聲分散后得到納米羥基磷灰石的懸濁液；
[0010](3)按羥基磷灰石、殼聚糖粉的配比為15mg-60mg:300mg，稱取適量殼聚糖粉末加入到上述羥基磷灰石的懸濁液中，攪拌后得到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石的混合液(混合均勻的殼聚糖/羥基磷灰石混合溶液)；
[0011](4)按輕基磷灰石、羧基化氧化石墨稀15-60mg:1.5_30mg，將羧基活化的羧基化氧化石墨烯邊攪拌邊滴加到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石的混合液中(羧基化氧化石墨烯的質量比為0.5-2.5% ),混合均勻后于60 °C條件下交聯30min，經冷凍干燥后得到殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。
[0012]所述步驟(1)中羧基化氧化石墨烯是氧化石墨烯通過氯乙酸法改性后所得的羧基化氧化石墨烯。
[0013]所述步驟(1)中所述交聯劑EDC和交聯劑NHS的濃度分別為10_30mM和20_60mM ；【交聯劑為乙基3(3 二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)和N羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯劑】。
[0014]所述步驟(2)中的羥基磷灰石的粒徑為40-60nm，稀醋酸的體積分數為2%。
[0015]所述步驟(4)中殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料中殼聚糖、氧化石墨稀、納米輕基磷灰石的質量比為300:(1.5-30): (15-60)。
[0016]所述步驟(4)的含有殼聚糖和納米羥基磷灰石的混合液中羧基化氧化石墨烯的質量百分比為0.5-2.5% wt.%
[0017]本發明通過羧基化氧化石墨烯與摻有納米羥基磷灰石的殼聚糖進行共價交聯反應來改善三維多孔支架的力學性能和生物活性。有利于細胞的粘附增殖，促進組織的迅速形成；而且機械性能得到改善，滿足組織修復部位所需的力學要求。
[0018]與現有的技術，本發明的有益效果是:
[0019](1)本發明采用冷凍干燥法制備的殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料，具有高的孔隙率，且孔與孔之間相互連通，有利于細胞向內生長及代謝產物與營養物質的交換。同時，制備方法操作簡單，通過改變殼聚糖、納米羥基磷灰石、氧化石墨烯的比例可調節復合支架材料的孔隙率、孔徑以及機械強度等性能參數；可根據實際需要任意制備各種形狀的支架材料。
[0020](2)本發明利用殼聚糖、納米羥基磷灰石、羧基化氧化石墨烯為原料制備的復合支架材料，不僅具有良好的力學性能，能滿足骨組織損傷修復的力學性能要求；而且各組分之間能相同協同，使支架材料具有更好的生物活性。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明實施例1的殼聚糖/氧化石墨烯(0.5wt.%)/納米羥基磷灰石(5wt.% )三維多孔支架掃描電鏡照片。
[0022]圖2是本發明實施例2的殼聚糖/氧化石墨烯(0.5wt.% )/納米羥基磷灰石(10wt.% )三維多孔支架掃描電鏡照片。
[0023]圖3是本發明實施例4的殼聚糖/氧化石墨烯(l.0wt.%)/納米羥基磷灰石(15wt.% )三維多孔支架掃描電鏡照片。
[0024]圖4是本發明實施例4的殼聚糖/氧化石墨烯(2.5wt.% )/納米羥基磷灰石(20wt.% )三維多孔支架掃描電鏡照片。
[0025]圖5是本發明實施例4的納米羥基磷灰石掃描電鏡照片。
[0026]圖6是本發明實施例4的氧化石墨烯(a)和羧基化氧化石墨烯(b) C Is的XPS圖
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[0027]圖7是本發明實施例4的不同殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石復合支架的機械性能圖；(a)拉伸強度，(b)抗壓強度。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例，對本發明作進一步說明:
[0029]實施例1
[0030]一種殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其具體步驟如下:
[0031](1)稱取1.5mg的羧基化氧化石墨稀于10mg的超純水中超聲分散形成均勾的分散液(濃度為15wt.% );將濃度為10-30mM、19.7-59.lmg交聯劑EDC和濃度為20_60mM、23.0-69.0mg交聯劑NHS加入到上述分散液中攪拌lh，活化羧基化氧化石墨稀上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；
[0032](2)取15mg納米羥基磷灰石(粒徑為40_60nm，或稱羥基磷灰石)于10mL體積分數為2%的稀醋酸溶液中，超聲分散后得到羥基磷灰石的懸濁液；
[0033](3)在上述羥基磷灰石的懸濁液中加入300mg的殼聚糖粉末，激烈攪拌后得到混合均勻的殼聚糖/納米羥基磷灰石混合溶液(復合物)【即得到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石混合液，以下實施例相同】，將所得殼聚糖/納米羥基磷灰石混合液置于4°C冰箱中2h去除氣泡；得到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石混合液；
[0034](4)將步驟(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨稀的質量百分比為0.5wt.%【即殼聚糖粉末300mg、輕基磷灰石15mg、羧基化氧化石墨稀1.5mg】，激烈攪拌均勾后，于60°C水浴條件下交聯30min，經冷凍干燥后得到殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料。
[0035]對本實施例中制得的殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料進行形貌表征。圖1為本實施例制備的多孔復合支架的掃描電鏡圖，如圖1所示，制備的復合支架具有高度多孔性，且孔與孔相互連通(具有高度連通的三維多孔結構)，納米羥基磷灰石均勻分布在復合支架中。
[0036]實施例2
[0037]—種殼聚糖/氧化石墨烯/納米羥基磷灰石三維多孔復合支架材料的制備方法，其具體步驟如下:
[0038](1)稱取1.5mg的羧基化氧化石墨稀于10mg的超純水中超聲分散形成均勾的分散液(濃度為15wt.% );將濃度為10-30mM、19.7-59.lmg交聯劑EDC和濃度為20_60mM、23.0-69.0mg交聯劑NHS加入到上述分散液中攪拌lh，活化羧基化氧化石墨稀上的羧基；得到羧基活化的羧基化氧化石墨烯；
[0039](2)取30mg納米羥基磷灰石(粒徑為40_60nm)于10mL體積分數為2 %的稀醋酸溶液中，超聲分散后得到納米羥基磷灰石的懸濁液；
[0040](3)在上述納米羥基磷灰石的懸濁液中加入300mg的殼聚糖粉末，激烈攪拌后得到混合均勻的殼聚糖/納米羥基磷灰石混合溶液，將所得殼聚糖/納米羥基磷灰石混合液置于4°C冰箱中2小時去除氣泡；
[0041](4)將步驟(1)中羧基活化的羧基化氧化石墨烯滴加到含有殼聚糖和納米羥基磷灰石混合液中，使羧基化氧化石墨稀的質量百分比為0.5wt.%【即殼聚糖粉末3