一種快速修復脫礦牙本質的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物材料技術領域，涉及一種快速修復脫礦牙本質的方法。
【背景技術】
[0002]
在牙本質粘接過程中，混合層基底裸露膠原不能被粘結劑完全包裹，暴露膠原遭內源性基質金屬蛋白酶降解是縮短樹脂一牙本質粘接復合體耐久性的關鍵因素。中度及深度齲齒病變也主要表現為牙本質層的脫礦。解決這些問題都涉及到對脫礦的牙本質進行再礦化。隨著研究的深入，牙本質顯微結構、成礦位點與膠原纖維之間的聯系，非膠原蛋白在牙本質生物礦化中的作用以及生物礦化過程逐漸被科學家揭示，并在體外仿生模擬，脫礦牙本質的修復領域進入了仿生再礦化的時代。目前主流的仿生再礦化方式為:用兩種牙本質非膠原蛋白的仿生類似物，在以Portland Cement作為I丐離子緩釋源的含磷溶液中成功地使酸蝕脫礦的牙本質再礦化，并且生成纖維內礦物和纖維外礦物。但是，這樣的方法耗時達四個月之久，不具備臨床實用性。而且，該裝置由緩釋鈣離子源，磷離子源，非膠原蛋白類似物等組成，太過復雜，難以讓臨床醫生從繁忙的工作中解脫。
[0003]近年對于納米級無定形磷酸鈣顆粒作為存在于生物礦化過程中的前驅體的研究越來越深入，有學者研究表明該顆粒內部高達10-20%的含水量和內部原子介于晶體和溶液的無序排列賦予了其類似液體的“流動性”，無定形顆粒憑借“流動性”預先復制模板的形貌和結構，然后逐漸失水、結晶、固化生成熱力學更穩定的結晶態礦物。無定形磷酸鈣的基本構成單元是Ca9(P04)6(Posner Cluster)，這種物質被稱作“小團簇”，尺寸大約為0.95nm，可以相互團聚為尺寸更大的礦物顆粒。
【發明內容】
[0004]
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種快速修復脫礦牙本質的方法。
[0005]本發明的主要構思是調控谷氨酸的濃度從而控制Posner Cluster的相變時間，間接調節了牙本質生物再礦化的速度，按照該方法可以大大縮短脫礦牙本質再礦化需要的時間。
[0006]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案是:
本發明首先合成無定形磷酸鈣顆粒，利用礦化促進劑加速脫礦牙本質的再礦化。
[0007]所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是:
用8?10 g/L聚丙烯酸作為無定形磷酸鈣的穩定劑，400 mM谷氨酸溶液作為再礦化促進劑。在36?38°C下，使用0.1?0.2 M、PH為9.5±0.1的磷酸氫二鈉水溶液和0.2?0.3 Μ氯化鈣水溶液配成母液；采用50 ml注射器在30?40分鐘內將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫二鈉水溶液中，反應過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用0.1 Μ氫氧化鈉溶液調控pH保持在9.5±0.5區間；使得鈣離子最終濃度為9.0?11.0 mM，磷離子的最終濃度為5.0?7.0 mM，谷氨酸的最終濃度為10?100 Mm。聚丙烯酸的最終濃度為300?1000 Pg/mL ;最終合成直徑為15?20 nm的無定形磷酸I丐顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存；
所述的再礦化脫礦牙本質具體是:
步驟1.收集無齲的離體牙，采用渦輪機將牙釉質磨除并在體式顯微鏡下檢查；慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸，取厚度為0.45?1_的牙本質片；
步驟2.將上述牙片放入質量濃度為30?35%的磷酸中，酸蝕過程中磷酸用磁力攪拌子攪拌，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2?5微米范圍內的脫礦牙本質層；
步驟3.取20?50 ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于樣品瓶中，將脫礦牙本質置于含有無定形磷酸鈣顆粒溶液中，將培養瓶密封；
步驟4.將上述樣品瓶放在35?38 °(:恒溫箱中，于2天后取出。
[0008]本發明的有益效果:具有良好的生物相容性；符合脫礦牙本質修復中提出的“最大限度保存牙體組織”原則，能以已有脫礦纖維為模板進行再礦化；相比于傳統礦化法，本方法由底部至上進行礦物生長，并且能夠在短時間內恢復脫礦牙本質的礦物含量，保護膠原不被基質金屬蛋白酶腐蝕，防止脫礦進一步發生，有利于維持良好的樹脂一牙本質粘接復合體耐久性；恢復了牙本質特殊的等級結構；恢復牙本質的力學性能；相比于已有的仿生礦化法，原料易得，體系簡單；更重要的是，本方法中礦化完成所需要的時間大大縮短，僅為2天，對于再礦化脫礦牙本質技術來講是一種突破。
【附圖說明】
[0009]圖la為實施例1，2，3，4中脫礦牙本質膠原的掃描電鏡(SEM)圖片。
[0010]圖lb為實施例1，2，3，4中脫礦牙本質膠原的透射電鏡(TEM)圖片。
[0011]圖2a為實施例1中濃度為50 ug/mL的聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的掃描電鏡(SEM)圖片；圖2b為實施例2中濃度為200 ug/mL的聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的掃描電鏡(SEM);圖2c為實施例1中濃度為50ug/mL的聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的透射電鏡(TEM);圖2d為實施例1中濃度為200 ug/mL的聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸鈣修復脫礦牙本質的透射電鏡(TEM)。
[0012]圖3a為實施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調控合成的無定形磷酸I丐顆粒在兩天時修復的脫礦牙本質中膠原纖維的顯微圖片；圖3b為實施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時修復的脫礦牙本質中膠原纖維的顯微圖片；圖3c為實施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時修復的脫礦牙本質的縱截面圖片；圖3d為實施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協同調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時修復的脫礦牙本質中膠原纖維的顯微圖片；圖3e為實施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸與10 mM Glu協同調控合成的無定形磷酸|丐顆粒在四天時修復的脫礦牙本質中膠原纖維的顯微圖片；圖3f為實施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協同調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在四天時修復的脫礦牙本質的縱截面圖片。
[0013]圖4a為實施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調控合成的無定形磷酸I丐顆粒在不同時間段的紅外(FTIR)圖片；圖4b為實施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mM Glu協同調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時間段的紅外(FTIR)圖片；圖4c為實施例3中350ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在2天時的透射電鏡(TEM)圖片；圖4d為實施例4中350 ug/mL的聚丙稀酸與10 mM Glu協同調控合成的無定形磷酸I丐顆粒在2天時的透射電鏡(TEM)圖片；圖4e為實施例3、4中劈裂峰值(splitting funct1n，SF)計算示意圖；圖4f中的靠右折線為實施例3中350 ug/mL的聚丙烯酸調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時間的SF圖譜，圖4f中的靠左折線為實施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10mM Glu協同調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時間的SF圖譜。
[0014]圖5a中下曲線為實施例1中50 ug/mL的聚丙稀酸調控下的不同無定形磷酸I丐顆粒在兩天時的紅外(FTIR)圖譜，圖5a中上曲線為實施例2中200 ug/mL的聚丙烯酸調控下的不同無定形磷酸I丐顆粒在兩天時的紅外(FTIR)圖譜；圖5b為實施例1中50 ug/mL的聚丙烯酸調控下的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時的透射電鏡(TEM)圖片；圖5c為實施例2中200 ug/mL的聚丙烯酸調控下的無定形磷酸鈣顆粒在兩天時的透射電鏡(TEM)圖片。
[0015]圖6為實施例3中350 ug/mL的聚丙稀酸調控合成的無定形磷酸I丐顆粒在不同的時間內修復的脫礦牙本質的納米壓痕強度和實施例4中350 ug/mL的聚丙烯酸與10 mMGlu協同調控合成的無定形磷酸鈣顆粒在不同時間內修復的脫礦牙本質的納米壓痕強度。
【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖和實施例對本發明進一步闡述:
實施例1:
配備0.25M氯化鈣(CaC12)水溶液，0.15M磷酸氫二鈉(Na2HP04)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實驗的母液。取2.4 mL Na2HP04母液和3.30mL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用1M NaOH水溶液調節pH至9.5±0.1，常溫攪拌0.5 h，總體積為30 mL。取2.4 mL CaC12母液加水稀釋至30 mL。用滴定管將30 mL鈣液30加入30 mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調控pH保持在9.5±0.5區間。最終，鈣離子濃度為10.0 mM，磷離子濃度為6.0 mM，PAA濃度為50 ug/mL。保證整個滴加過程持續25?30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機垂直于牙長軸先切除牙釉質，再切取厚度為0.5?1 mm的牙本質片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2?3微米范圍內的脫礦牙本質模型；取15 ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養瓶中，將脫礦牙本質模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養瓶放在37.5°C恒溫箱中，分別于2、4天后取出。將再礦化的牙本質樣本一分為二，一半用酒精梯度脫水的方式進行干燥，做掃描電鏡(S