用于組織再生的包含膠原和prp的組合物的制作方法
【技術領域】 [0001] 和【背景技術】
[0002] 本發明，在其一些實施方案中，涉及用于組織再生并且，更特別地，但不完全用于 軟組織再生的包含膠原和富血小板血漿（PRP)的組合物。
[0003] 富血小板血漿（PRP)是富集血小板的血漿。作為自體血小板的濃縮來源，PRP含 有（并且通過脫粒釋放）幾種不同的生長因子和刺激骨和軟組織愈合的其它細胞因子。
[0004] 隨著血小板通過經由α-顆粒脫粒釋放局部作用生長因子而引發傷口修復，PRP 起到組織封閉劑和藥物遞送系統的作用。血小板的α-顆粒中所含的分泌蛋白包括血小板 源生長因子（PDGF-AA、BB和ΑΒ異構體）、轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板因子4 (PF4)、 白細胞間素-l(IL-l)、血小板源血管生成因子（PDAF)、血管內皮生長因子（VEGF)、上皮生 長因子（EGF)、血小板源內皮生長因子（PDEGF)、上皮細胞生長因子（ECGF)、胰島素樣生長 因子（IGF)、骨鈣素（0c)、骨粘連蛋白（On)、纖維蛋白原（Ff)、玻連蛋白（Vn)、纖連蛋白 (Fn)和血小板反應蛋白-l(TSP-l)。這些生長因子通過吸引新形成的基質中的未分化細胞 并觸發細胞分裂而幫助愈合。PRP可抑制細胞因子釋放并限制炎癥，與巨噬細胞相互作用以 提高組織愈合和再生，促進新毛細血管生長，并加速慢性傷口中的上皮形成。
[0005] PRP中的血小板通過生成吸引巨噬細胞的信號蛋白在傷口部位的宿主防御機制 中也起作用；PRP也可含有少量合成作為非特異性免疫反應的一部分的白細胞間素的白細 胞。
[0006] PRP向損傷部位的遞送和滯留由于其液體狀態并且因此物質可能向周圍組織損失 而仍然是一個挑戰。凝血酶（主要為牛源性）是用于凝塊形成和增加PRP膠凝化的常見血 小板活化因子。凝血酶的使用具有幾個缺點。凝血酶在人類中具有不良免疫反應。另外，體 外研究已顯示出對細胞增殖和活力的抑制（LawsonJH.SeminThrombHemost，2006 ;32(增 刊 1)98-110;MurrayMM等，JOrthopRes. 2007 35(1)第 81-91 頁）。
[0007] 發現天然介入內在凝血級聯的I型膠原是用于血小板活化的凝血酶的有吸引力 的替代物。除了是哺乳動物結締組織中的主要蛋白組分外，I型膠原是研究最多的用于再 生醫學和組織工程學的天然支架。
[0008] 幾項體外研究調查了從受凝血酶或膠原活化的PRP凝塊的細胞因子釋放以便表 征其釋放曲線（TsayRC等，JOralMaxillofacSurg，2005 63 第 521-528 頁；FufaD等， JOralMaxillofacSurg，2008 66(4)第684-690頁）。經證實呈不同物理狀態、可溶或原 纖維的I型膠原在幾天內刺激TGF、PDGF和VEGF的釋放與凝血酶一樣有效。培育經凝血酶 或I型膠原活化的PRP的培養物長達15天并且證實基于膠原的凝塊在大部分基于凝血酶 的凝塊降解時保持其初始形狀和尺寸。
[0009] Laci等，YaleJBiolMed. 2010March;83(1) :1 -9 教導稱氯化鈣可用于活化PRP 凝塊。
[0010] 美國專利申請第20120201897號教導了用于活化PRP凝塊的氯化鈣和I型膠原的 組合。
【發明內容】
[0011] 根據本發明一些實施方案的一個方面，提供了一種包含交聯膠原、富血小板血漿 (PRP)和無機鹽的物質組合物。
[0012] 根據本發明一些實施方案的一個方面，提供了一種包含膠原、富血小板血漿（PRP) 和無機鹽的物質組合物，其在37°C下培育10天后能夠釋放超過4000pg/ml的血小板源生長 因子（TOGF)。
[0013] 根據本發明一些實施方案的一個方面，提供了一種在有需要的受試者中治療傷口 或誘導組織再生的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的本文所述的物質組合物， 從而治療所述傷口或誘導組織再生。
[0014] 根據本發明一些實施方案的一個方面，提供了一種生成用于治療傷口或誘導組織 再生的物質組合物的方法，其包括：
[0015] (a)生成膠原和無機鹽的混合物；并且
[0016] (b)使所述混合物與PRP接觸，從而生成用于治療傷口或誘導組織再生的所述物 質組合物。
[0017] 根據本發明的一些實施方案，所述無機鹽選自鈉鹽、氯鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、磷酸 鹽、硫酸鹽和羧酸鹽。
[0018] 根據本發明的一些實施方案，所述無機鹽選自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0019] 根據本發明的一些實施方案，所述無機鹽為CaCl2。
[0020] 根據本發明的一些實施方案，所述物質組合物呈液態。
[0021] 根據本發明的一些實施方案，所述物質組合物呈半固態。
[0022] 根據本發明的一些實施方案，所述物質組合物可縫合。
[0023] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原包含人膠原。
[0024] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原包含I型膠原。
[0025] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原包含原纖化膠原。
[0026] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原包含重組膠原。
[0027] 根據本發明的一些實施方案，所述重組膠原在植物中生成。
[0028] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原以約10_50mg/ml的濃度存在。
[0029] 根據本發明的一些實施方案，所述膠原以約20-30mg/ml的濃度存在。
[0030] 根據本發明的一些實施方案，所述氯化鈣以約7_60mM的濃度存在。
[0031] 根據本發明的一些實施方案，所述物質組合物能夠在37°C下在約6-7分鐘內產生 凝塊。
[0032] 根據本發明的一些實施方案，所述凝塊可縫合。
[0033] 根據本發明的一些實施方案，所述組合物在37°C下培育30天后耐降解。
[0034] 根據本發明的一些實施方案，所述受試者具有腱或骨疾病。
[0035] 根據本發明的一些實施方案，所述組織為腱或骨。
[0036] 根據本發明的一些實施方案，所述物質組合物用于在受試者中治療傷口或誘導組 織再生。
[0037] 根據本發明的一些實施方案，所述無機鹽選自鈉鹽、氯鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、磷酸 鹽、硫酸鹽和羧酸鹽。
[0038] 根據本發明的一些實施方案，所述無機鹽選自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0039] 根據本發明的一些實施方案，所述方法還包括在所述接觸之前干燥所述混合物。
[0040] 根據本發明的一些實施方案，通過原纖化重組膠原溶液獲得所述膠原。
[0041] 根據本發明的一些實施方案，所述方法還包括在所述原纖化之后交聯所述膠原。
[0042] 根據本發明的一些實施方案，所述干燥包括冷凍-干燥。
[0043] 根據本發明的一些實施方案，所述方法還包括在所述接觸之前用水合溶液水合所 述干燥之后的所述混合物。
[0044] 根據本發明的一些實施方案，所述水合溶液包含貧血小板血漿（PPP)。
[0045] 根據本發明的一些實施方案，所述交聯通過使所述膠原與EDC或DHT接觸而實現。
[0046] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和/或科學術語均具有本發明所屬領域 中普通技術人員通常所理解的相同含義。雖然在本發明實施方案的實踐或試驗中可使用與 本文所述類似或等效的方法和材料，但是下面描述的是示例性方法和/或材料。如有沖突， 以專利說明書，包括定義為準。另外，所述材料、方法和實例僅為說明性而非旨在為必要性 限制。
【附圖說明】
[0047] 本文僅以舉例的方式，參考附圖描述了本發明的一些實施方案。現詳細地具體參 考附圖，強調所示細節僅舉例而言并且是為了說明性討論本發明實施方案的目的。就這一 點而言，隨附圖所做的描述使得對于本領域中的技術人員而言可如何實踐本發明的實施方 案顯而易見。
[0048] 圖中：
[0049] 圖1為根據本發明的示例性實施方案，通過使用兩個注射器混合PRP的裝置的照 片。一個注射器裝有水合膠原的懸浮液。另一個注射器裝有PRP。通過用盧爾鎖（luer lock)連接兩個注射器進行混合。
[0050] 圖2A-D為基于凝血酶-PRP的凝塊（A、B)和基于rh膠原-PRP的凝塊（C、D)的 SEM圖像。比例尺10μm。可以觀察到血小板細胞成分形成截留在原纖維成分（纖維蛋白） 之間的細胞聚塊。rh膠原纖維被截留在纖維蛋白成分中。
[0051] 圖3A-B說明了凝塊形成10天后來自于兩種類型的rh膠原制劑（交聯原纖化膠 原和非交聯原纖化膠原）相對于受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(A)及來自于30mg/ml 交聯rh膠原相對于受凝血酶活化、受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(B)的TOGF生長因 子的體外累積釋放曲線。
[0052] 圖4為與凝血酶+PRP和PBS+CaCl2+PRP的對照相比基于rh膠原的凝塊的剪應 力-應變曲線。通過rh膠原薄片與CaCl2+PRP直接混合（膠原直接混合）或通過首先用 PBS水合rh膠原薄片，然后與CaCl2+PRP混合（經由PBS的rh膠原）獲得兩種類型的基于 rh膠原的凝塊。
[0053] 圖5A-B為說明2天（圖5A)和12天（圖5B)后與基于凝血酶的凝塊（藍色圓 圈）相比，基于rh膠原的凝塊的降解測定的體內結果的照片。可清楚地觀察到基于凝血酶 的凝塊完全降解。基于rh膠原的凝塊在相同時間段內保持穩定。
[0054] 圖6A-B說明了接種3和7天后nHDF細胞增殖的結果。圖6A表示通過使用WST染 色檢測到的定量增殖。圖6B展示了對于30mg/ml原纖維、30mg/ml原纖維交聯膠原的凝塊 樣品及基于CaCljPPBS+PRP(無rh膠原）的混合物的凝塊而言，3和7天后在transwell 周圍增殖的細胞的顯微鏡檢查。
【具體實施方式】
[0055] 本發明，在其一些實施方案中，涉及用于組織再生并且，更特別地，但不完全用于 軟組織再生的包含膠原和富血小板血漿（PRP)的組合物。
[0056] 在詳細解釋本發明的至少一個實施方案之前，應理解本發明在其應用上不一定限 于以下描述中提出或通過實施例舉例說明的細節。本發明能夠有其它實施方案或以各種方 式實踐或實施。
[0057] PRP是具有濃縮血小板的血漿。在PRP中發現的血小板高度濃縮并且包含生長因 子，以及大量對激活和加速組織修復和再生至關重要的生物活性蛋白。生物活性蛋白增加 了引發結締組織的愈合、骨再生和修復、新血管的促進和傷口愈合過程的刺激的干細胞的 產生。
[0058] 除非經由凝血機制實現膠凝化，否則呈液體形式的PRP施加于傷口部位可伴有 PRP大量損失到周圍間隙中。目前使用牛凝血酶實現膠凝化。
[0059] 雖然牛凝血酶是有效的血小板活化因子，但是也引起抗凝血酶、凝血酶原、因子V 和心磷脂的抗體發展，及在動物研究中作為結果而發生的范圍從嚴重術后出血到類似于狼 瘡的自身免疫綜合征的臨床問題。使用牛凝血酶還導致成纖維細胞通過膠原-PRP凝塊的 迀移受損，以及凝塊的強度受損。另外，用凝血酶-活化凝塊所見的高度凝縮使其難以用于 傷口-間隙填充應用。
[0060] 本發明人提出使用膠原作為PRP的活化因子，由此配制膠原以便控制生長因子從 凝塊釋放的速率。例如，如圖3A-B所示，本發明人證實與使用非交聯膠原活化PRP凝塊時 相比，當使用交聯膠原活化PRP凝塊時釋放更多的血小板源生長因子（PDGF)。另外，本發明 人提出可向制劑中添加氯化鈣以控制凝塊形成所需的時間。
[0061] 雖然為實踐而簡化了本發明，但是本發明人已經證實膠原在PRP凝塊中起填料的 作用，由此膠原纖維被截留在凝塊的纖維蛋白成分中（圖2A-B)。有人提出膠原使纖維蛋白 成分相互連接的能力是造成凝塊強度和可縫合性的原因。
[0062] 因此，根據本發明的一個方面提出了一種包含交聯膠原、富血小板血漿（PRP)和 氯化鈣的物質組合物。
[0063] 如本文中所用，短語"富血小板血漿"是指血小板的濃度高于外周血液的血漿。雖 然正常血小板計數范圍可從約140, 000至約400, 000個/微升，但是PRP的一些血小板濃 度可在約500, 000至約1，200, 000/微升或更高的范圍內。PRP可由全血形成，并且可使用 自體、異體或混合的血小板和/或血漿來源獲得。PRP可由多種動物來源，包括人類來源形 成。
[0064] 通常，PRP可含有95%血小板與