穩定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚體疫苗及其使用方法

文檔序號：9509262閱讀：1067來源：國知局

穩定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚體疫苗及其使用方法
【專利說明】穩定的人免疫缺陷病毒（HIV)包膜（EnV)三聚體疫苗及其使用方法
[0001] 關于聯邦資助研究的聲明本發明在由國立衛生研究院（NationalInstitutesofHealth(NIH))/國家過敏和感染性疾病研究院（NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases (NIAID))所授予的基金號AI096040和AI084794的政府支持下進行。政府享有本發明的某些權利。
[0002] 發明背景引出對抗病毒的細胞免疫應答的疫苗試圖反映全球病毒的多樣性以有效治療或預防病毒感染。對于HIV疫苗，穩固及各種各樣的人免疫缺陷病毒（HIV)-特異性T細胞應答的引發是有效的HIV疫苗所需要的。高度可變的包膜蛋白（Env)是對抗HIV的中和抗體的主要目標，且可根據引出這些抗體應答來配合制備疫苗抗原。為此，積極尋求模擬天然HIV病毒體上的Env的三聚體結構的免疫原作為基于抗體的HIV疫苗。然而，已證明難以產生引出各種各樣的中和抗體應答的生物化學上穩定的三聚體的Env免疫原。
[0003]因此，本領域中存在對于開發疫苗的未得到滿足的需求，所述疫苗包括新穎的、優化的三聚體的Env免疫原，所述三聚體的Env免疫原可廣泛引出中和抗體應答以允許更成功的HIV接種結果。
[0004] 發明概述在第一方面，本發明以具有三個gpl40多肽的穩定的三聚體為特征，其中至少一個（如兩個或每個）gpl40多肽包括與SEQIDNO: 2 (mEnv+)具有至少90%同一性（如至少91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDN0: 2 (mEnv+)的序列的氨基酸序列。
[0005] 在相關的第二方面，本發明以具有三個gpl40多肽的穩定的三聚體為特征，其中至少一個（如兩個或每個）gpl40多肽包括基本上具有SEQIDNO: 1 (mEnv)或SEQIDN0: 3 (cEnv)的序列（如99%或更多同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1 (mEnv) 或SEQIDNO: 3 (cEnv)的序列的氨基酸序列。
[0006] 在一些實施方案中，所述穩定的三聚體是異源三聚體。所述穩定的多肽異源三聚體可包括兩個嵌合Envlgpl40多肽（如mEnv和/或mEnv+)，其各自包括與SEQIDNO: 1 或 2具有至少 90% 同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1或2的序列的氨基酸序列，及一個分化體（clade)C Envgpl40 多肽（如具有SEQIDNO: 3 的 "cEnv"），其包括與SEQIDNO: 3 (cEnv)具有至少90%同一性（如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 3 (cEnv)的序列的氨基酸序列（如兩個mEnv和一個cEnv; 兩個mEnv+和一個cEnv;或一個mEnv、一個mEnv+、和一個cEnv)。在其它實施方案中，所述穩定的異源三聚體可包括一個嵌合Envlgpl40多肽（如mEnv和/或mEnv+)，其包括與 SEQIDNO: 1 或 2 具有至少 90% 同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1或2的序列的氨基酸序列，及兩個分化體CEnvgpl40多肽（如cEnv)，其各自包括與SEQIDNO: 3具有至少90%同一性（如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQ IDNO: 3的序列的氨基酸序列（如一個mEnv和兩個cEnv;-個mEnv+和兩個cEnv)。在一些實施方案中，穩定的異源三聚體包括兩種不同的嵌合Envl序列的組合（如一個mEnv和兩個mEnv+ ;兩個mEnv和一個mEnv+ ;或一個mEnv、一個mEnv+、和cEnv)。在一些實施方案中，穩定的異源三聚體包括cEnv和相同的Envl多肽中的兩個（如兩個mEnv和一個cEnv; 兩個mEnv+和一個cEnv)。在其它實施方案中，穩定的異源三聚體包括一個cEnv和兩個不同的嵌合Envl多肽（如一個cEnv、一個mEnv，和一個mEnv+)。在其它實施方案中，穩定的異源三聚體包括兩個cEnv多肽和一個嵌合Envl多肽（如兩個cEnv和一個mEnv、或兩個 cEnv和一個mEnv+)。
[0007] 或者，可制備穩定的gpl40Env三聚體，其中三聚體中的一個或兩個gpl40Env多肽中具有SEQIDNO: 4的序列（嵌合gpl40Env2，"mEnv2"）或SEQIDNO: 5的序列（嵌合gpl40Env3，"mEnv3")。在另一實施方案中，所述穩定的三聚體具有三個gpl40多肽，其中至少一個（如兩個或每個）gpl40多肽包括與SEQIDN0: 4或5具有至少90%同一性 (如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有 SEQIDN0: 4或5的序列的氨基酸序列。優選地，以與修飾mEnv、mEnv+、或cEnv(其各自擁有三聚化結構域）類似的方式來修飾mEnv2或mEnv3,如下文討論。因此，在本發明的一些實施方案中，可制備穩定的gpl40Env三聚體，其具有下列組成的多肽：一個mEnv和兩個 mEnv2 ;兩個mEnv和一個mEnv2 ;-個mEnv+ 和兩個mEnv2 ;兩個mEnv+ 和一個mEnv2 ; - 個cEnv和兩個mEnv2 ;兩個cEnv和一個mEnv2 ; -個mEnv、一個mEnv+、和一個mEnv2 ; 一個mEnv、一個cEnv、和mEnv2 ; -個mEnv+、一個cEnv、和一個mEnv2 ; -個mEnv和兩個 mEnv3 ;兩個mEnv和一個mEnv3 ; -個mEnv+ 和兩個mEnv3 ;兩個mEnv+ 和一個mEnv3 ; 一個cEnv和兩個mEnv3 ;兩個cEnv和一個mEnv3 ; -個mEnv、一個mEnv+、和一個mEnv3 ; 一個mEnv、一個cEnv和mEnv3 ; -個mEnv+、一個cEnv、和一個mEnv3 ; -個mEnv、一個 mEnv2、和一個mEnv3 ; -個mEnv+、一個mEnv2、和一個mEnv3 ;或一個cEnv、一個mEnv2、和一個mEnv3〇
[0008] 在第三方面，本發明以包括第一或第二方面的穩定的三聚體的組合物為特征。在實施方案中，第三方面的組合物包括一種或更多種不同的穩定的三聚體。在其它實施方案中，所述不同的穩定的三聚體（一種或更多種）具有三個gpl40多肽，其中至少一個（如兩個或每個）gpl40多肽包含與SEQIDN0: 1、2、3、4或5具有至少90%同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一1性）的氨基酸序列，或包含具有SEQID NO: 1、2、3、4或5的序列的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述不同的穩定的三聚體（一種或更多種）可為同三聚體或異源三聚體。在一些實施方案中，第三方面的組合物進一步包括藥學上可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑、和/或佐劑。
[0009] 在第四方面，本發明以包括第三方面的任一種組合物的疫苗為特征。在一些實施方案中，疫苗用于治療有需要的對象中人免疫缺陷病毒（HIV)感染或降低其免疫缺陷病毒 (HIV)感染風險。在一些實施方案中，在給藥至對象之后，疫苗引出中和抗-HIV抗血清（如中和抗-HIV-1抗血清）的產生。抗-HIV抗血清可中和例如選自分化體A、分化體B、和分化體C的任一種或更多種的HIV(如HIV-1)。. 在第五方面，本發明以具有編碼至少一種（如兩種、或三種或更多種）gpl40多肽的核苷酸序列的核酸分子為特征，其中至少一種gpl40多肽包括：（a)與SEQIDNO: 1具有至少95%同一性（如至少96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或具有SEQIDN0:1 的序列的氨基酸序列；（b)與SEQIDNO: 2具有至少95%同一性（如至少96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或具有SEQIDNO: 2的序列的氨基酸序列；或（c)具有SEQ IDNO: 3的序列的氨基酸序列；⑷具有SEQIDNO: 4的序列的氨基酸序列；（e)具有SEQ IDNO: 5的序列的氨基酸序列或它們的組合物。在一些實施方案中，核酸分子進一步包括核苷酸序列，其編碼一種或更多種不同的（如第二、第三、或第四）gpl40多肽（如與SEQID NO: 1、2、3、4和/或5具有至少95%同一性（如至少96%、97%、98%、或99%同一性），或具有SEQIDNO: 1、2、3、4和/或5的序列的gpl40多肽）。在一些實施方案中，核酸分子包括一個或更多個內部核糖體進入位點（IRES)序列以允許來自單核酸分子轉錄物的多重肽 (multiplepeptide)或多肽鏈的表達。
[0010] 在第六方面，本發明以包括第五方面的一種或更多種核酸分子的載體為特征。在一些實施方案中，所述載體為腺病毒載體或痘病毒載體。腺病毒載體可來源于，例如，重組腺病毒血清型11 (Adll)、腺病毒血清型15(Adl5)、腺病毒血清型24(Ad24)、腺病毒血清型 26 (Ad26)、腺病毒血清型34 (Ad34)、腺病毒血清型35 (Ad35)、腺病毒血清型48 (Ad48)、腺病毒血清型49 (Ad49)、腺病毒血清型50 (Ad50)、Pan9 (AdC68)、或其嵌合變體（如腺病毒血清型5HVR48(Ad5HVR48))。痘病毒載體可源于，例如，修飾的安卡拉痘苗病毒（MVA)。在第七方面，本發明提供治療有需要的對象中HIV感染或降低其HIV感染風險的方法，所述方法通過向對象（例如哺乳動物，例如，人）施用治療有效量的本發明的組合物（如第一或第二方面的任一種穩定的三聚體、第三方面的組合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）。根據本發明的該第七方面，治療可為治療性的或預防性的。
[0011] 在第八方面，本發明提供減少感染HIV的對象中HIV介導的活動的方法，所述方法通過向對象施用治療有效量的本發明的組合物（如第一或第二方面的任一種穩定的三聚體、第三方面的組合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）。在一些實施方案中，HIV介導的活動為病毒傳播、感染、或細胞融合。細胞融合可為，例如，靶細胞進入或合胞體形成。在一些實施方案中，與治療之前的對象的HIV滴度或感染HIV 但未用本發明組合物（一種或更多種）治療的對照對象的HIV滴度相比，在向對象（例如哺乳動物，例如，人）施用疫苗之后，感染HIV的對象中的HIV滴度減小（如至少約5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多。
[0012] 在一些實施方案中，經下列途徑施用所述組合物（如疫苗）：肌內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、外用（topically)、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊內、粘膜、心包內、臍內 (intraumbilically)、眼內、口服、外用（topically)、局部（locally)、通過吸入、通過注射、通過灌輸、通過持續灌輸、通過局部灌注直接浸浴靶細胞、通過導管、通過灌洗、通過管飼法、以乳霜或以脂質組合物。在一些實施方案中，向對象施用至少一劑量（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、或更多劑量）的組合物或每天、每周、每月、或每年向對象施用至少一劑量（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多劑量）。可限定施用周期（如1-4周、1-12個月、1-20年）或可持續對象的一生。在其它實施方案中，向對象施用至少兩劑量（如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、或更多劑量）的組合物。在又一實施方案中，將組合物作為基礎免疫（prime)組合物或加強免疫（boost)組合物或以基礎-加強免疫（prime-boost)方案向所述對象施用。在優選的實施方案中，將本發明的一種或更多種組合物（如疫苗）作為加強免疫施用。
[0013] 在另一優選的實施方案中，本發明以治療對象中HIV感染或降低其HIV感染風險的方法為特征，所述方法通過以基礎-加強免疫接種方案中的基礎免疫組合物施用疫苗，所述疫苗包括第一多肽，所述第一多肽與SEQIDN0: 6具有至少85%氨基酸序列同一性 (如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一1性），或具有 SEQIDN0: 6的序列，或包括至少一種包括編碼該第一多肽的第一核酸分子的第一載體 (如腺病毒或痘病毒載體）。任選地，也可將第二多肽與第一多肽組合施用，所述第二多肽與SEQIDN0: 7 具有至少 85% 同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、或99%同一性），或具有SEQIDN0:7的序列，或，若施用編碼第一多肽的第一載體，則可將包括編碼第二多肽的第二核酸分子的第二載體（如腺病毒或痘病毒載體）與第一載體組合施用。基礎-加強免疫方案中的加強免疫組合物可包括一種或更多種本發明的組合物（如第一或第二方面的任一種穩定的三聚體、第三方面的組合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）。在另一實施方案中，基礎 -加強免疫方案中的基礎免疫組合物可包括具有SEQIDN0: 8-32中任一種序列（一種或更多種）的多肽（一種或更多種），或一種或更多種包括編碼SEQIDN0: 8-32中任一種的核酸分子的載體，然后包括一種或更多種本發明的組合物的加強免疫（如第一或第二方面的任一種穩定的三聚體、第三方面的組合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）。
[0014] 在其它實施方案中，一種或更多種本發明的組合物（如疫苗）作為基礎-加強免疫方案中的基礎免疫組合物施用且加強免疫組合物是不同的疫苗組合物，如包括以下的疫苗：一種或更多種多肽，所述多肽與任一種或更多種SEQIDN0: 6-32的序列具有至少85% 氨基酸序列同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一性），或具有任一種或更多種SEQIDNO: 6-32(優選SEQIDN0: 6和/或7的多肽），或包括一種或更多種載體（如腺病毒或痘病毒載體），所述載體各自包括編碼一種或更多種多肽的核酸分子，所述多肽與一種或更多種SEQIDN0: 8-32具有至少85%同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性），或具有一種或更多種SEQIDN0: 8-32的序列（優選編碼SEQIDN0: 6和/或7的多肽的載體）。
[0015] 在一些實施方案中，例如，可向對象以非載體組合物施用本發明的多肽組合物 (如本發明的穩定的gpl40Env三聚體）。施用的多肽組合物可包括介于約1Pg和1mg 之間的穩定的Env三聚體，并更優選包括介于50Pg和300Pg之間的本發明的穩定的Env 三聚體。
[0016] 在輸送載體為病毒的其它實施方案中，可向對象施用至少約lxlO3病毒顆粒（vp)/ 劑量或介于ΙχΙΟ1和1x10 14vp/劑量之間、優選介于lxl〇3和1x10 12vp/劑量之間、并更優選介于lxlO5和lxlO11vp/劑量之間。可在暴露前或診斷前例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、30、35、40、45、50、55、或60分鐘，2、4、6、10、15、或24小時，2、3、5、或7天，2、4、6或 8周，或甚至3、4、或6個月施用所述組合物，或可在HIV診斷后或暴露于HIV后15-30分鐘或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、20、24、48、或 72 小時，2、3、5、或 7 天，2、4、6 或 8 周，3、4、6、或9個月，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長時間向對象施用。每天、每周、每月或每年向所述對象施用一次一或更多劑量的組合物。當治療HIV感染時，可在HIV感染或疾病 /綜合征（如獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS))的癥狀出現或確診之前，或在診斷或癥狀變得明顯之后向對象施用本發明的組合物（一種或更多種）（如第一、第二、或第三方面的任一種穩定的三聚體、第四或第五方面的組合物、第六方面的疫苗、第七方面的核酸分子、和/ 或第八方面的載體）。可在例如，癥狀的診斷或臨床識別之后立即施用所述組合物（一種或更多種）或在癥狀的診斷或檢測后2、4、6、10、15、或24小時，2、3、5、或7天，2、4、6或8周，或甚至3、4、或6個月施用所述組合物（一種或更多種）。
[0017] 在第九方面，本發明提供用于治療有需要的對象中HIV感染或降低其HIV感染風險的疫苗的制備方法。所述方法包括以下步驟：(a)將本發明第二方面的核酸（如進一步包括第八方面的載體的核酸）與細胞接觸；及（b)使核酸在細胞中表達以形成穩定的三聚體。在一些實施方案中，所述方法經體外或離體（exw>o)實施。在一些實施方案中，所述細胞是細菌、植物或哺乳動物的細胞（如人或非人哺乳動物的細胞）。在優選的實施方案中，所述哺乳動物的細胞是293T細胞。
[0018] 在最后的方面，本發明以試劑盒為特征，所述試劑盒包括：(a)本發明的組合物 (如第一、第二、或第三方面的任一種穩定的三聚體、第四或第五方面的組合物、第六方面的疫苗、第七方面的核酸分子、和/或第八方面的載體，如包括mEnv和/或mEnv+三聚體和 cEnv三聚體的疫苗）；(b)藥學上可接受的載體、賦形劑、或稀釋劑；及（c)其使用說明。所述試劑盒可任選地包括佐劑。
[0019] 在本發明所有方面的優選的實施方案中，所述對象是哺乳動物，優選靈長類，例如人。
[0020] 定義在此使用的術語"約"表示所列舉值的+/- 10%。
[0021] "腺病毒"表示中等尺寸的（90-100nm)、非包膜的二十面體病毒，其包括衣殼和雙鏈線型DNA基因組。所述腺病毒可為天然存在的、但孤立的腺病毒（如sAd4287、sAd4310A、或sAd4312)或為重組腺病毒（如復制缺陷型或有復制能力的sAd4287、sAd4310A、或 sAd4312、或它們的嵌合變體）。
[0022] 在此使用的"施用"表示向對象給予一定劑量的藥物組合物（如本發明的組合物，例如第一或第四方面的任一種疫苗、第三方面的組合物、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）的方法。可經下列途徑施用在此描述的方法中使用的組合物，例如，肌內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、外用、瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊內、粘膜、心包內、臍內、眼內、口服、外用、局部、通過吸入、通過注射、通過灌輸、通過持續灌輸、通過局部灌注直接浸浴靶細胞、通過導管、通過灌洗、通過管飼法、以乳霜或以脂質組合物。優選的施用方法可取決于各種因素（如施用組合物的組分和欲治療的病情的嚴重性）而改變。
[0023] 在此使用的術語"分化體"是指根據它們的遺傳相似性分類的相關人免疫缺陷病毒（HIV)。目前存在三組HIV-1分離株：M、N和0。Μ組（主株）由至少十個分化體，A到J 構成。0組（外圍株）可由相似數目的分化體構成。N組是既未被分類至Μ組又未被分類至 0組的新的HIV-ι分離株。在某些示例性的實施方案中，在此描述的本發明的組合物（如第一或第四方面的任一種疫苗、第三方面的組合物、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的載體）將識別并引起對抗二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多個分化體和/或兩組或更多組HIV的免疫應答（如中和抗-HIV抗血清）。
[0024] 貫穿本說明書和權利要求，將理解詞語"包含（comprise)"，或變型例如"包括 (comprises) "或"含有（comprising,) "意味著包括所述整數或整數組但不排除任何其它整數或整數組。
[0025] 在此使用的術語"包膜糖蛋白"是指，但不限于，在HIV病毒體的包膜表面和感染 HIV的細胞的質膜表面上表達的糖蛋白。辦κ基因編碼gpl60,所述gpl60經蛋白水解裂解成gpl20和gp41包膜（Env)蛋白。Gpl20在具有⑶4受體的靶細胞（例如，如T-輔助細胞）上結合此類受體。Gp41以非共價方式結合gpl20,并提供第二個步驟，通過所述步驟 HIV進入細胞。gp41原本掩埋在病毒包膜內，但是當gpl20結合⑶4受體，gpl20改變自身構型導致gp41被暴露，在此它可協助與宿主細胞的融合。
[0026] "基因產物"表示包括自基因轉錄的mRNA，及自那些mRNA翻譯的多肽。
[0027] "異源核酸分子"或"異源基因"表示可被插入本發明的載體（如腺病毒或痘病毒載體）中的任何外源核酸分子（如編碼本發明的優化的gpl40Env多肽的核酸分子），用于轉移至細胞、組織、或有機體，用于由異源核酸分子或基因編碼的感興趣的基因產物或其片段的后續表達。在優選的實施方案中，可向作為本發明一部分的細胞或對象施用的異源核酸分子可包括，但不限于，編碼至少一種優化的嵌合Env多肽（如嵌合Envl多肽，例如 mEnv和mEnv+)和/或分化體CEnv多肽（如分化體CEnvl多肽，例如cEnv)的核酸分子。
[0028] "人免疫缺陷病毒"或"HIV"表示慢病毒屬的病毒，其為逆轉錄病毒漢e&oKirii/ad家族的一部分，并包括，但不限于，HIV-1型（HIV-1)和HIV-2型（HIV-2) 兩種感染人類的HIV。
[0029] "免疫應答"表示對象（如人）的免疫系統對于抗原或抗原決定簇的任何應答。示例性的免疫應答包括體液免疫應答（如抗原特異性抗體，如中和抗體（NAb)的產生）和細胞介導的免疫應答（如淋巴細胞增殖）。
[0030] 在此使用的關于HIV的術語"減少"是指HIV介導的活動（如感染、融合（如靶細胞進入和/或合胞體形成）、病毒傳播等）的減少或降低和/或病毒效價的降低。與對照對象 (如未經治療的對象或采用安慰劑治療的對象）相比，HIV介導的活動和/或HIV滴度可降低 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、99. 2%、 99. 3%、99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%、99. 9% 或更多。
[0031] "中和

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