一種高效新城疫dna疫苗的分子佐劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于疫苗技術領域，特別涉及一種高效新城疫DNA疫苗的分子佐劑及其制 備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 新城疫是由新城疫病毒引起的禽類的急性、高度接觸性傳染病，免疫預防新城疫 一直應用滅活疫苗或者弱毒苗，但是滅活疫苗免疫保護期短，而弱毒苗免疫保護效果好，但 存在潛在毒力返強及與野毒基因重組的危險，因此，對DNA疫苗的研究越來越多。F基因是 NDV的主要毒力因子與保護性抗原，但是，根據文章表明，單獨的F基因構建的DNA疫苗通 過普通的肌肉注射，是達不到理想保護效率，因此，對分子佐劑和免疫途徑則需要進行進一 步的探索。IL-12是一種由的異源二聚體蛋白組成的細胞因子，編碼IL-12兩個亞基（p35、 P40)的基因位于不同的染色體上，二者分別合成后再通過亞基間二硫鍵結合成具有生物學 活性的二聚體分子（P70)。單獨的亞基不具有生物學作用，IL-12能夠促進T淋巴細胞、NK 細胞的分化與增殖，調控細胞免疫，提高NK/LAK細胞的殺傷功能和特異性CTL細胞的應答 能力，誘導γ干擾素的產生；因此，選擇IL12作為佐劑能夠增強核酸疫苗的免疫效果。此 外，電穿孔是功能強大的將核酸、蛋白及其它分子導入多種細胞的高效技術。通過高強度的 電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質中的外源分子。與普通的肌肉注射 相比，電穿孔能有效的減免DNA疫苗在進入細胞過程中的損失，提高了疫苗的表達效率，有 效地減少了劑量，提高免疫效果。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種高效新城疫DNA疫苗 的分子佐劑。所述的分子佐劑為重組雞白細胞介素12(rhIL-12)真核表達載體，所述的 rIL-12真核表達載體（pCAGGS-IL12)與DNA疫苗共同通過電穿孔的方法免疫動物，發揮分 子佐劑的作用。rIL-12佐劑能夠克服新城疫DNA疫苗研究中保護率較低的困難，提供一種 有效的DNA疫苗佐劑及一種高效率的免疫途徑。
[0004] 本發明的另一目的在于提供上述分子佐劑的制備方法。
[0005] 本發明的再一目的在于提供上述分子佐劑的應用。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：一種高效新城疫DNA疫苗的分子佐劑，為 重組雞白細胞介素12(rhIL-12)的真核表達載體pCAGGS-IL12。
[0007] 所述的重組雞白細胞介素12通過下述的四對引物擴增的獲得：
[0008] IL12亞單位P40的擴增引物對：
[0020] 上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐劑的制備方法為：
[0021] 采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接頭連接的方案獲取rIL-12的P40、P35融合基 因，融合基因插入真核表達質粒PCAGGS，構建pCAGGS-IL12。上述載體的構建方法不僅可保 證P40、P35兩亞基以1 : 1比率表達，而且柔性氨基酸接頭可使兩個亞基充分延展、正確折 疊，從而獲得最大的生物學活性。
[0022] 上述的采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接頭連接的方案獲取rIL-12的P40、P35融 合基因的制備方法，包括以下步驟：
[0023] (1)首先單獨設計引物分別擴增IL12亞單位P40和P35,獲得IL12亞單位P40和 P35基因片段，其中IL12亞單位P40的擴增引物對序列如下：
[0029] (2)以步驟（1)擴增獲得IL12亞單位P40和P35基因片段為模板，用含酶切位點 和互補的linker(G4S) 3的連接引物去擴增，獲得IL12亞單位P40和P35基因的拼接片段， 上游目的基因P40去掉終止密碼子TTA，下游目的基因P35去掉起始密碼子ATG，所述的連 接引物如下：
[0030] 其中，IL12亞單位P40的拼接引物對序列如下：
[0036] (3)再次分別以步驟⑵膠回收獲得的拼接片段產物按照總量1:1的比例，加入 Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，進行第一輪PCR反應，循環數為8~12 ;第一輪PCR反應后取 出2μL反應混合物作為模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2為模版，進行第二輪PCR，循 環數28~35 ;產物回收，送測序鑒定正確后獲得采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接頭連接 的方案獲取rIL-12的Ρ40、Ρ35融合基因。
[0037] 上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐劑的應用，具體體現在將重組雞白細胞介素 12 (rhIL-12)真核表達載體與新城疫DNA疫苗共同通過電穿孔的方法免疫動物，重組雞白 細胞介素12 (rhIL-12)真核表達載體發揮分子佐劑的作用。
[0038] pCAGGS-IL12的基因佐劑功能研究：pCAGGS-IL12與pCAGGS-F核酸疫苗通過電穿 孔方法在SPF雞體內共免疫。檢測其對核酸疫苗的基因佐劑功能。
[0039] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0040] 本發明成功地構建了重組雞白細胞介素12的單鏈雙亞基真核表達質粒 (PCAGGS-IL12)，不僅可保證P40、P35兩亞基以1:1比率表達，而且柔性氨基酸接頭可使 兩個亞基充分延展、正確折疊，從而獲得最大的生物學活性。PCAGGS-IL12與pCAGGS-F核酸 疫苗通過電穿孔方法在SPF雞體內共免疫，可顯著增強核酸疫苗的免疫效果，發揮理想的 基因佐劑功能。本發明中rIL-12佐劑能夠克服新城疫DNA疫苗研究中保護率較低的困難， 提供一種有效的DNA疫苗佐劑及一種高效率的免疫途徑。電穿孔方法減免DNA疫苗在進入 細胞過程中的損失，提高了疫苗的表達效率，減少了疫苗有效使用量，經濟實用。
【附圖說明】
[0041] 圖1為實施例1中PCR檢測的結果圖；其中圖1:M:MarkerDL:2000， l-13:pCAGGS-IL12 菌液PCR;14:PCR陰性對照。
[0042] 圖2為間接免疫熒光結果檢測的結果圖；其中：A為pCAGGSHL12轉染，B為空載 體pCAGGS轉染。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0044] 實施例1
[0045] 1.實驗所用主要材料和試劑：本發明使用的真核表達載體為pCAGGS。雞白細胞介 素12基因由脾臟擴得。P40、P35兩個亞基由linker(G4S)3連接，本連接不僅可保證P40、 P35兩亞基以1 : 1比率表達，而且柔性氨基酸接頭可使兩個亞基充分延展、正確折疊，從而 獲得最大的生物學活性。使用的限制性內切酶EcoRl、Xhol，T4DNA連接酶、ExTaq酶、預 混RTaq等均為普通試劑。
[0046] 2.擴增引物設計：引物的設計及合成是根據國內外已在GenBank中登錄的雞白 細胞介素12基因序列經多重比較后設計。在啟動子前，酶切位點之后加入Kozak序列 "GCCACC";根據真核表達載體pCAGGS上的酶切位點，上游引物設計并加上EcoRl酶切位點； 下游引物設計在基因末端，并加上Xho1酶切位點。
[0047] 所述的重組雞白細胞介素12通過下述的四對引物擴增的獲得：
[0048] IL12亞單位P40的擴增引物對：
[0062] 3.雞白細胞介素12基因片段的擴增：雞白細胞介素12基因的PCR獲取，研磨脾 臟，提取RNA，反轉為cDNA，以cDNA為模板，加入Ex Taq DNA聚合酶、引物、dNTP進行擴增 反應。
[0063] ?0?的反應體系為：，4父(1犯1311^(2.5臟〇1/1)4 4 1^上、下游引物（2(^111〇1/1)各 1 μ L，cDNA 1. 5 μ L，ddH20 41. 5 μ L，Ex Taq酶1 μ L。
[0064] PCR反應參數為：94°C處理4min，然后94°C 30s、55°C 30s、72°C 2min，共35個循環， 72°C延伸lOmin。PCR產物在1. 0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可分別見約950bp和650bp40和 ILp35的擴增條帶，融合后可見大小與預期的結果（目標長度1605bp)-致的IL12條帶，初 步確定擴增片段的正確性。
[0065] 4.雞白細胞介素12基因克隆入pMD-19T Vector :將雞白細胞介素12基因的 PCR產物用Omega膠回收試劑盒進行膠回收。雞白細胞介素12基因的PCR純化產物連接 入pMD_19T Vector，載體連接反應體系為：Ligation Solution I 5yL、PCR純化產物 4. 5 μ L、pMD-19T Vector 1 μ L ;16°C連接過夜，將連接產物轉化DH5a感受態細胞，在含有 氨芐青霉素的LB平板上37°C培養；挑選單個菌落，進行PCR鑒定，并抽提質粒，送測序鑒 定。