用于治療神經退行性變疾病的α-突出核蛋白和其疫苗的模擬表位的制作方法
【專利說明】用于治療神經退行性變疾病的α-突出核蛋白和其疫苗的 模擬表位
[0001] 本申請是基于申請日為2009年2月23日，優先權日為2008年2月22日，申請 號為200980105866. 6 (PCT/AT2009/000071)，發明名稱為："用于治療神經退行性變疾病的 α-突出核蛋白和其疫苗的模擬表位"的專利申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及一種待用于預防和/或治療突觸核蛋白病（synucleinopathy)的醫 藥。
[0003] 突觸核蛋白病是一組具有下述共同病理學特征的不同神經退行性變疾病：在神經 病理學檢查中可檢測出含有異常α-突出核蛋白（α-syn)蛋白質聚集于選定種群的神經 元和神經膠質細胞中的特征性損傷。a-syn(起初鑒別為PARK1和PARK4)是廣泛表達于新 皮質、海馬、齒狀回、嗅球、紋狀體、丘腦和小腦的140個氨基酸的蛋白質。α-syn還在造血 細胞，包括B-、T-和NK細胞，以及單核細胞和血小板中高表達。其在這些細胞中確切的作 用尚為未知，但已發現其涉及巨核細胞（血小板的前體）的分化。
[0004] 最常見的突觸核蛋白病包括但不僅限于Lewy體病（Lewybodydisorder，LBD)， 如帕金森氏病（PD)，帕金森氏病伴癡呆（PDD)，癡呆伴Lewy體，以及多系統萎縮（MSA)或 神經退行性變伴腦鐵聚集I型（BrainIronAccumulationTypeΙ,ΝΒΙΑType1)。對這 些疾病的現行治療手段包括針對癥狀的藥物，如L-多巴、抗膽堿能藥以及單胺氧化酶抑制 劑。然而，所有現行的治療手段僅僅導致癥狀緩解，而無法在患者中誘導長期持續的疾病減 輕作用。
[0005]Lewy體病是以震顫、強直、運動徐緩（bradykinesia)和腦中多巴胺能神經元的喪 失為特征的進行性的神經退行性變疾病。在DLB和PDD的情況下，癥狀還包括認知缺損。在 西方國家高于60歲年齡的人群中高至2%發展出H)/LPD的典型癥狀。目前，僅有針對癥 狀的治療方法。不幸的是，這些療法僅僅提供對早期癥狀的暫時緩解，而無法停止疾病的進 行。
[0006]PD/LBD的發病機理仍然未完全理解，但看來該疾病的發展牽涉到遺傳易感性和環 境因素。雖有遺傳學方面的所有進展，PD/LBD仍主要是未知原因的散發病癥（亦稱為自發 性H)/LPD)。罹患該疾病的患者在腦的皮質和皮質下區域內發展出稱為Lewy體（LB)的特 征性的泛素化（ubiquitinated)胞內包涵物（inclusion)。特別是在具有高多巴胺能神經 元或神經投射（neuronalprojection)的區域顯示這種類型的病理學特征。
[0007] 近來，數個研究顯示突觸蛋白a-syn在LBD發病中起中心作用。在LBD中，a-syn 在遍及受影響的腦區域中的LB中積聚。此外，可以表明a-syn中的單個點突變（single pointmutation)以及雙倍或多倍增殖（duplicationormultiplication)與罕見的家 族型帕金森氏綜合癥相關。重要的是，基于來自轉基因（tg)小鼠以及果蠅（Drosophila melanogaster)的過表達研究的結果，理解了其在FO/LBD發病中關鍵作用，這是由于這些 動物模型模擬了ro的數種特征。
[0008] 另一種非常重要的突觸核蛋白病是多系統萎縮（MSA)。MSA是以耐L-D0PA帕金 森氏綜合癥、小腦性共濟失調和家族性自主神經異常癥狀為特征的自發的神經退行性變疾 病。患者遭受影響不同腦區域，包括紋狀體、黑質、小腦、腦橋以及下橄欖體和脊髓的多系統 神經元喪失（neuronalloss)的痛苦。MSA以遍及中央神經系統的α-syn-陽性的神經膠 質細胞質包涵物（glialcytoplasmicinclusion,GCI)和罕見的神經元包涵物（neuronal inclusion)為特征。這些包涵物與紋狀體黑質變性（striatonigraldegeneration)、橄欖 體腦橋小腦萎縮相關，并涉及延髓和脊髓中的自主神經核。GCI對于MSA發病的重要性已被 廣泛接受，并因近來對分析在少突膠質細胞中α-syn過表達的作用的轉基因小鼠模型的 分析而格外顯得重要。在過表達人類α-syn的tg小鼠中，觀察到了似GCI聚集物和MSA 的生物化學標記。
[0009] 盡管a-Syn積聚導致在突觸核蛋白病中神經退行性變典型特征以及突觸核蛋白 病的特征性癥狀的準確機理尚未完全理解，最近的研究暗示a-syn寡聚物的異常形成和 積聚涉及突觸核蛋白病中根本的退行性變過程。現在相信上述的寡聚物形成，例如，在突出 末端和軸突中的，在H)/LBD發展中起重要作用。因此減少a-syn的沉積和寡聚化應對于 治療突觸核蛋白病，特別是自發性的LBD/H)和MSA是有利的，并且可以首次提供除僅僅減 輕癥狀的現行治療策略，如施用L-D0PA外的治療這些神經退行性變疾病的策略。
[0010] 在IwatsuboT.(Neuropathology27 (5) (2007) : 474-478)中，檢查了α-突觸核 蛋白以及其磷酸化與α-突觸核蛋白病的發病的關聯。該出版物的作者發現沉積于突觸核 蛋白病病變中的α-突觸核蛋白的絲氨酸129廣泛的被磷酸化。
[0011] US2007/213253涉及突變的人類α-突觸核蛋白，以及自其衍生，可用于抑制野 生型人類α-突觸核蛋白聚集的肽。
[0012] 在W0 2004/041067中，公開了供預防或治療與α-突觸核蛋白聚集相關疾病的手 段和方法，包括使用α-突觸核蛋白片段。
[0013] 在US2003/166558中，描述了可用于誘導針對蛋白質沉積物免疫應答的肽。
[0014] US2005/198694涉及包括至少100個氨基酸并具有C-末端1到23個氨基酸缺失 的α-突觸核蛋白片段。
[0015] 盡管使用神經營養因子和移植多巴胺能細胞的實驗性療法產生讓人覺得有前途 的結果，仍需要設計用來減少a-syn神經元積聚的替代手段。
[0016] 近來，主動和被動免疫療法作為針對神經退行性變疾病，如阿爾茨海默氏癥（AD)， 月元疾病（PrionDisease)以及亨廷頓舞蹈癥（ChoreaHuntington)和淀粉狀蛋白側索硬化 (amyloidlateralsclerosis，ALS)的潛在的新治療策略逐漸引人注目。舉例而言，最近 的對AD的tg模型的研究顯示，針對β-淀粉狀蛋白1-42 (Αβ)的抗體促進淀粉狀蛋白自 腦中去除，導致認知能力的改善。重要的是，Αβ分子主要位于胞外，因此構成免疫系統可 接近的表位。與上述免疫療法的"經典"靶相對，進行實驗衡量減少胞內病源分子積聚的潛 在免疫療法。已顯示靶向朊蛋白和亨廷頓蛋白（huntingtin)的免疫接種手段在tg小鼠的 神經元中對減少上述兩種類似a-syn在胞內積聚的分子是有效的。此外，最近的實驗還描 述了抗-Tau和抗S0D1療法分別作為在AD和ALS中針對胞內病原性蛋白質聚集物的新穎 治療策略。因此，已積累了具有說服力的證據證明腦細胞中的胞內聚集可作為免疫療法的 靶。事實上，近來顯示了相似的治療突觸核蛋白病的潛力。過表達人類a-syn的tg小鼠 經人類α-syn蛋白質接種。在接種后產生高相對親和力的小鼠中，在神經元細胞體和突觸 中聚集的a-syn積聚減少，其與神經退行性變減少相關。進一步，由經免疫化的動物產生 的抗體亦檢測到了以異常聚集形式存在與神經元膜相關的a-syn，并促進這些聚集物的降 解，可能是通過溶酶體途徑。使用以外源施加的α-syn特異性抗體的被動免疫療法觀察到 相似的作用。這些結果表明接種對減少α-syn聚集物的神經元積聚是有效的，且對該方法 的進一步發展可對治療LBD和突觸核蛋白病產生有益作用。
[0017] 本發明的目標是提供基于育苗預防和治療突觸核蛋白病的藥物。
[0018] 因此本發明涉及使用至少一種包含下述氨基酸序列的化合物：
[0019](X1)nX2X3PVX4X5X6(X7)n (式 1)，
[0020] 其中
[0021] &是任何氨基酸殘基，
[0022]&是選自下組的氨基酸殘基：天冬氨酸（D)和谷氨酸（E)，
[0023] X3是任何氨基酸殘基，
[0024] X4是任何氨基酸殘基，
[0025] X5是選自下組的氨基酸殘基：脯氨酸（P)和丙氨酸（A)，
[0026]&是選自下組的氨基酸殘基：天冬氨酸（D)和谷氨酸（E)，
[0027] X7是任何氨基酸殘基，
[0028] η和m，彼此獨立，是0或大于0的整數，
[0029] 且其中式I的氨基酸序列并不包括α-突觸核蛋白具有氨基酸序列DMPVDTON的 8聚體多肽片段，且并不與其等同，所述化合物具有對針對包含氨基酸序列DMPVDTON的 α-突觸核蛋白表位具有特異性的抗體的結合能力，以供產生供預防和/或治療突觸核蛋 白病的藥物。
[0030] 本發明的化合物能夠誘導在體內產生導向（結合）α-突觸核蛋白，特別是包含氨 基酸序列DMPVDPDN的α-突觸核蛋白表位的抗體（亦包括含所述氨基酸序列的α-突觸 核蛋白片段）。然而，導向（結合）所述表位的抗體，與針對α-突觸核蛋白相比較，針對 β-突觸核蛋白不顯示或僅顯示顯著較低的免疫反應性。與之相對，由用含DMPVDTON的原 始α-突觸核蛋白表位的免疫化誘導的抗體令人驚訝的結合于α-突觸核蛋白和β-突觸 核蛋白兩者。因此，與原始α-突觸核蛋白或其片段不同，本發明的化合物提供了針對所述 與疾病相關分子的特異性，并避免了與和疾病不相關的突觸核蛋白的交叉反應性。這 就效率和安全性而言顯示了強烈的優越性，尤其是后者，因為已有對β-突觸核蛋白的神 經保護特性的描述。他811加〇仂]\16七&1.，181〇1〇16111.2004]\&^28 ;279(22):23622-9· HashimotoM,Neuron. 20010ct25 ；32 (2):213-23〇
[0031] 由施用本發明化合物誘導的a-突觸核蛋白特異性抗體可能不僅結合于單體形 式的α-突觸核蛋白，還與其多聚形式結合。這使得減少在待治療的個體體內α-突觸核 蛋白寡聚物的量成為可能。減少alpha-突觸核蛋白對于治療突觸