促進畜禽生長的GM-CSF基因與SS基因共表達DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物醫藥生物工程領域，尤其是一種促進畜禽生長的粒細胞-集落刺 激因子GM-CSF基因與生長抑素 SS基因共表達DNA疫苗PIRES-GM-CSF/2SS的方法。
【背景技術】
[0002] 對于肉用的動物來說，生長速度、產肉率、飼料利用率等是衡量肉用動物的主要指 標，可以從營養方面調控，也可以從生長發育方面調控。
[0003] 動物的生長軸是由動物體內下丘腦-垂體-靶器官及其相關的激素和受體 所組成的具有自動調節的神經內分泌系統。下丘腦釋放生長激素釋放因子（Growth hormone-releasing factor，GRF)、生長抑素（Somatostatin，SS)等相關的激素，但是最重 要的是GRF和生長激素 （Growth hormone，GH)。其中GRF是促進垂體釋放生長激素，進而 促進動物的生長。而SS則是抑制垂體釋放GH，也就是說其具有抑制動物生長的作用。接 著GH又可以直接作用于靶器官，或者通過肝臟分泌的胰島素樣生長因子（Insulin-like growth fact〇rs，IGFs)再作用于靶器官，這就是動物生長軸的機理。動物的生長受到很多 激素的調節，但是最重要的是GRF和SS，含有SS的生長抑素基因疫苗表達產生的抗體中和 內源性SS，間接使GRF激素的分泌含量增加，從而促進畜禽的生長；粒細胞-集落刺激因子 (GM-CSF)是一種具有多項潛能的造血生長因子，在細胞因子網絡中占有重要地位，具有免 疫增強作用，能增強生長抑素 DNA疫苗的免疫效果。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種促進畜禽生長的GM-CSF基因與SS基因共表達DNA疫苗 PIRES-GM-CSF/2SS的方法，該基因疫苗一次注射，能同時表達出SS和GM-CSF兩個完全獨立 的蛋白，從而減少了工作量及對免疫動物的應激影響，能保持獨立的免疫原性，增強了免疫 效果。
[0005] 本發明的目的是這樣實現的： 一種促進畜禽生長的GM-CSF基因與SS基因共表達DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS的方 法，特征是：具體步驟如下： A、 將pIRES (共表達質粒載體）質粒用I和及I進行雙酶切，以pVGS/2ss-asd 質粒為模板，PCR獲取豬GM-CSF基因，膠回收GM-CSF基因與T載體進行連接反應，構建陽 性重組質粒pIRES-GM-CSF ; B、 以pVGS/2ss-asd質粒為模板，用和III進行雙酶切，PCR獲取豬SS基因， 用Abi I和I進行雙酶切與T載體進行連接反應，構建T2SS質粒； C、 采用Abi I和I內切酶分別酶切pIRES-GM-CSF質粒和T2SS質粒，將純化、回收 的pIRES-GM-CSF大片段和2SS片段進行連接反應，構建真核表達質粒pIRES-GM-CSF/2SS， 得到DNA疫苗pIRES-GM-CSF/2SS (GM-CSF基因與SS基因共表達DNA疫苗)。
[0006] pIRES-GM-CSF/2SS疫苗是在真核表達載體pIRES的MCS A和MCS B兩個多克隆位 點分別插入GM-CSF和SS基因，在真核動物中可同時獨立表達出完全獨立的GM-CSF和SS 蛋白，可用來促進畜禽生長。
[0007] PIRES-GM-CSF/2SS疫苗采用一次注射，它能同時表達出SS和GM-CSF兩個完全獨 立的蛋白，從而減少了工作量及對免疫動物的應激影響，能保持獨立的免疫原性，增強了免 疫效果。
【附圖說明】
[0008] 圖1為本發明的pIRES-GM-CSF/2SS質粒的構建圖。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合實施例并對照附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0010] 一種促進畜禽生長的GM-CSF基因與SS基因共表達DNA疫苗PIRES-GM-CSF/2SS 的方法，具體步驟如下： 1共表達基因疫苗PIRES-GM-CSF/2SS的構建及鑒定方法(技術路線見圖1) 1.1引物的設計與合成 采用Primer 5. 0軟件設計引物，分別根據豬的GM-CSF序列和2SS片段(含有乙肝表面 抗原S基因）序列設計擴增GM-CSF和2SS片段的引物(見表1)，設計引物由上海生物工程 有限公司合成。
[0011] 1.2 pIRES質粒的提取與酶切 將pIRES質粒轉入感受態大腸桿菌A cWi DH5a中，鋪板與擴大培養后挑取單菌落進 行培養，采用質粒提取試劑盒提取質粒pIRES，然后進行酶切，酶切體系為：10 XM buffer 1. 0 μ L、ZAa I 0· 2 μ L、方coR I 0· 2 μ L、pIRES 質粒 2 μ L、ddH20 至總體積 10 uL，37 °C，反應2-3 h，酶切后，用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。
[0012] 1. 3 pIRES-GM-CSF 質粒的構建 1.3. 1 GM-CSF基因的擴增 按試劑盒說明書抽提和純化pVGS/2SS-asd質粒。以pVGS/2SS-asd質粒為模板，按照 如下PCR反應體系進行GM-CSF基因的擴增：5XBuffer 2 yL、d NTP 0. 4 yL、Taq DNA聚 合酶 0.4 yL、引物 pl、p2 各 0.5 yL、pVGS/2SS-asd質粒 L5 yL、ddH20 至合計 20 yL。 按以下條件進行PCR反應：94 °C變性6 min，然后，94 °C變性1 min、51 °C退火1 min、72 。(:延伸1 min，35個循環后72 °C續延10 min、16 °C降溫5 min。PCR產物1.0 %瓊脂糖電 泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。
[0013] 1. 3. 2 GM-CSF基因與T載體相連 按照如下連接體系將GM-CSF基因與T載體進行相連：PCR的產物GM-CSF 4 μ L、T-載 體1 yL，35 °C反應15 min，將反應產物轉化感受態DH5a中，培養后，采用質粒提取試劑盒 提取質粒TGM-CSF質粒。然后按以下酶切體系進行酶切鑒定：T-GMCSF質粒2 I 0.1 yL、方coR I 0.3 yL、10X M Buffer 1 yL、加 dd H20 至總體積 10 yL，鑒定正確的 質粒送往北京奧科生物技術有限公司測序，備用。
[0014] 1.3.3 pIRES-GM-CSF 質粒的構建 純化后的pIRES質粒和TGM-CSF質粒分別用船e I和I雙酶切，酶切體系分別為： pIRES 質粒 12 I 0.4 yL、此oR I 0.8 yL、10XM Buffer2 yL、加 dd H20 至總 體積20 yL;TGM-CSF 12 μL、Λ*??Ι 0.2 yL、方coR I 0.2 yL、10XM Buffer 2 yL、加 dd H20至總體積20 μ L，37 °C，反應2-3 h，酶切后，用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，分別分離回收 pIRES大片段和GM-CSF片段，備用。
[0015] 然后，將回收、純化的PIRES大片段和GM-CSF片段按如下體系進行連接反應： pIRES 載體線性片段 1 yL、GM-CSF 線性片段 4 yL、5XT4LigaseBuffer2 yL、T4DNA Ligase 1 yL、ddH20 2 yL、共計 10 yL，23°C 水浴，連接 20min〇
[0016] 1· 3· 4陽性重組質粒（pIRES-GM-CSF)的篩選和鑒定 將連接產物轉化感受態A cWi DH5a細菌，固體培養基鋪板培養，挑取陽性克隆，LB培 養，提取質粒DNA，進行酶切鑒定，酶切體系為：陽性克隆2 I 0. 1 yL、此〇R I 0.3 yL、10XM Buffer 1 yL、dd H20 至總體積 10 yL，37 °C，反應 2-3 h，1.0 % 瓊脂糖 電泳檢測，電泳條帶與目的條帶大小相符，鑒定正確的質粒送往北京奧科生物技術有限公 司測序，獲得的陽性克隆命名為PIRES-GM-CSF。
[0017] 1. 4 PIRES-GM-CSF/2SS 質粒的構建 1.4. 1 2SS基因的擴增 以pVGS/2SS-asd質粒為模板，按照如下PCR反應體系進行SS基因的擴增：5XBuffer 2 yL、dNTP0.4 yL、TaqDNA 聚合酶 0.4 yL、引物 p3、p4 各 0.5 yL、pVGS/2SS-asd 模板1. 5 μ L、ddH20至總體積20 μ L，按以下條件進行PCR反應：94 °C變性6 min，然后 94 °C 變性 1 min、54.9 °C 退火 1 min、72 °C 延伸 1 min，35 個循環后，72 °C 續延 10 min、 16 °C降溫5 min，PCR產物1. 0 %瓊脂糖電泳檢測，膠回收，純化和定量，備用。
[0018] 1.4.2 T2SS質粒的構建 將2SS的PCR產物與T