一種通過基因改造血管內皮細胞促進創面愈合的方法及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉基因工程技術及器官修復重建領域，具體涉及一種通過基因改造血管內 皮細胞促進創面愈合的新方法，及其將該方法應用于制備皮膚移植物促進創面愈合。
【背景技術】
[0002] 創面愈合是一種涉及多種細胞及分子的復雜過程，主要包括炎癥期、增生期和重 塑期三個階段。傷口愈合的第一個時期是炎癥期，傷口形成后傷口或組織裂隙內為血凝塊 所充填，其周圍組織發生急性炎癥，各種炎癥介質的釋放和炎癥細胞浸潤使傷口表現為 紅、腫、熱、痛，在這一過程中，纖維細胞、肌成纖維細胞于傷后6h在傷口邊緣出現，24~48h 有血管內皮細胞增生，逐漸形成新生毛細血管。增生期成纖維細胞、內皮細胞和新生毛細血 管共同構成肉芽組織充填裂隙，同時肉芽組織內膠原纖維逐漸增多，使得其硬度與張力強 度隨之增加，逐漸變為纖維組織架接于斷裂的組織之間，即瘢痕修復；同時上皮細胞、成骨 細胞和成軟骨細胞等增生，使傷口邊緣皮膚新生上皮，直到傷口初步愈合。在塑形期，隨著 機體狀態的好轉和活動恢復，通過各種酶的作用和運動應力作用，調整瘢痕組織內的膠原 纖維含量和排列，使其軟化而不影響張力強度，從而適應生理功能，至此傷口修復過程遂告 完成。在這相互交錯的3個過程中，炎癥反應、血管通透性、傷口血管化以及肉芽組織生長 和上皮細胞增殖都是影響到傷口愈合的重要因素。
[0003] 關于創面移植干細胞促進創面愈合的研究有很多，其治療作用主要是通過發揮旁 分泌和免疫調節功能，調控組織周同相關細胞以及改善微環境等作用參與修復和重建。
[0004] 近年來的研究表明慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而 達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細 胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因修飾與治療的效果。在美 國已經開展了慢病毒介導的基因治療的臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前 景（Dong A, Rivella S, Breda L. Gene therapy for hemoglobinopathies:progress and challenge. Transl Res. 2013 Jan 18.pii:S1931-5244(12)00447-1·)。
[0005] Nogo基因是近些年來發現的新基因，目前發現Nogo基因編碼的三種蛋白：Nogo A、Nogo B和Nogo C，均是中樞神經系統髓鞘中具有抑制神經生長活性的跨膜蛋白。目前 研究發現，Nogo-B與腫瘤抑制、凋亡、神經系統再生抑制、血管內膜損傷修復等多種病理 生理過程有不同程度的關系。其在血管內皮細胞和平滑肌細胞中高表達，有促進內皮細 胞迀移和抑制平滑肌細胞的功能，在損傷再生和血管修復重塑方面發揮重要作用。（參見 文南犬：Lili Gao, TeruoUtsumi, KeitaroTashiro, etc. Reticulon 4B (Nog〇-B)Facilitates Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 2013Mar ； 57 (5):1992-2003. ；Annarita Di Lorenzo, Thomas D. Manes,AlbertoDavalos,etc. Endothelial reticulon_4B (Nogo_B)regulatesICAM-1 - mediated leukocyte transmigration and acute inflammation. Blood. 2011, 117(7) :2284 - 95 ；Jun Yu，Car losFernandez-Hernando, YajairaSuarez, etc. Reticulon 4B(Nogo~B)isnecessary for macrophage infiltration and tissue repair. PNAS, 2009, 106(41):17511-17516)〇
[0006] 基因修飾可調節細胞增殖，并調節細胞分泌生長因子參與創面愈合。目前較為安 全的基因修飾方法是慢病毒感染。慢病毒基因載體是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病 毒載體，作為一種高效的基因轉染載體應用越來越廣泛，經多次修飾改造其轉導效率和安 全性都得到了保證。
[0007]目前尚無文獻報道有關Nogo-B基因修飾人臍靜脈血管內皮細胞，以促進人創面 愈合的研究及應用。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供跨膜蛋白Nogo-B的新用途；本發明的另一目的在于提供 一種促進創面愈合的方法；以及該方法在制備皮膚移植物中的應用。
[0009] 本發明的構思如下：
[0010] 申請人基于Nogo-B可調節內皮細胞迀移，抑制平滑肌細胞等實驗依據，構建含目 的基因 Nogo-B特定干擾序列的慢病毒干擾載體，將其轉染人臍靜脈血管內皮細胞，獲得 Nogo-B低表達的臍靜脈血管內皮細胞，稱之為HUVEC-siNogoB，將其注射至裸鼠全層創面 周圍，觀察其創面愈合情況。并通過冰凍切片證明細胞在創面存活情況，體外實驗檢測其自 身血管成環情況以及對成纖維細胞增殖迀移的影響。
[0011] 本發明的主要技術方案如下：首先是根據Nogo-B的基因結構，設計RNA干擾 序列，構建Nogo-BRNAi慢病毒載體。通過查閱文獻確定Nogo-B基因特定的干擾序列 為：CAGAATCTATGGACTGAAT (Jun Yu, CarlosFernandez-Hernando, YajairaSuarez, etc. Reticulon 4B(Nogo-B)isnecessary for macrophage infiltration and tissue repair. PNAS, 2009, 106 (41) : 17511-17516)。構建 Nogo-BRNA 干擾的慢病毒載體為：GV248-Nog〇-B RNAi-GFP，將Nogo-B的干擾慢病毒感染人臍靜脈血管內皮細胞。
[0012] 最后，本發明將GV248-Nogo_B RNAi-GFP顆粒感染臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC)， 實驗發現，Nogo-B下調后臍靜脈血管內皮細胞本身增殖減慢，但可以明顯促進創面愈合。
[0013] 本發明的第一方面，提供了跨膜蛋白Nogo-B在制備（皮膚）創面愈合（修復）藥 物或試劑中的應用。
[0014] 所述的藥物或試劑為降低跨膜蛋白Nogo-B的表達量的藥物或試劑。
[0015] 所述的藥物或試劑包含以下任一：
[0016] A)含有跨膜蛋白Nogo-B干擾序列的重組載體；
[0017] B)含有跨膜蛋白Nogo-B干擾序列的重組病毒；
[0018] C)跨膜蛋白Nogo-B低表達的血管內皮細胞；
[0019] Nogo-B 的 GENBANK 號：NG_029037. 1
[0020] 所述的干擾序列為Nogo-B的siRNA、shRNA等。
[0021] 優選的，所述的跨膜蛋白Nogo-B干擾序列，如下：
[0022] CAGAATCTATGGACTGAAT (SEQ ID N0:1)
[0023] 其中B)，優選為，含有跨膜蛋白Nogo-B干擾序列的慢病毒；
[0024] 慢病毒載體的構建方法可以選用本領域常規方法，例如參見：耿運琪主編，慢病毒 與泡沫病毒分子生物學文選，南開大學出版社。
[0025] 在本發明的一個優選實施例中，所用的慢病毒載體為GV248,構建獲得的 Nogo-BRNA 干擾的慢病毒載體為：GV248-Nog〇-B RNAi -GFP。
[0026] 所述的藥物或試劑包含重組慢病毒GV248-Nogo_B RNAi-GFP。
[0027] 其中C)，優選為，跨膜蛋白Nogo-B低表達的臍靜脈血管內皮細胞；
[0028] Nogo-B低表達的臍靜脈血管內皮細胞的構建方法可以選用本領域常規方法，例 如參見：Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A, Weber K，Tusc