用于減少脂肪的方法及相關組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發明是申請日為2005年5月19日、申請號為200580015906. X、發明名稱為"用 于減少脂肪的方法及相關組合物"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 相關參考
[0003] 本申請案主張優先于2004年5月19日提出申請的美國臨時申請案第60/572, 879 號，其全部內容皆以引用的方式并入本文中。
技術領域
[0004] 本發明是關于用于非外科去除局部脂肪積累的組合物及方法。特定而言，本發明 是關于適用于直接注射至需要去除脂肪的患者治療部位的藥理活性清潔劑組合物，而無需 外科手術干涉。
【背景技術】
[0005] 在一個句子末尾括號中出現的數字是指申請專利范圍之前討論此說明書時所列 舉的特定參考文獻。
[0006] 含磷脂酰膽堿及膽汁鹽的調配物（磷脂酰膽堿膽汁鹽調配物，PBF)正逐漸用于治 療局部脂肪積累（1-8)。若干開放性標記臨床研究已報道利用注射PBF用于治療包括下眼 瞼脂肪疝出及"水牛背"脂肪營養障礙在內的局部脂肪積累的有價值結果（1-3)。
[0007] 磷脂酰膽堿是一種天然磷脂，其是細胞膜的一種主要成份且對于正常細胞膜構成 及修復很重要。磷脂酰膽堿也是主要營養物膽堿的主要遞送形式。膽堿自身是神經遞質乙 酰膽堿、甲基供體甜菜堿及磷脂（尤其包括磷脂酰膽堿及鞘磷脂）合成中的一種前體。磷 脂酰膽堿也包括極低密度脂蛋白的肝輸出物。
[0008] 膽汁鹽已經用于提高磷脂酰膽堿、且最近諸如兩性霉素 B、Taxol?及地西泮 (diazepam)等藥物的水溶性（9-14)。高度純化的磷脂酰膽堿可與次級膽汁鹽脫氧膽酸鈉、 抗微生物劑、芐醇及水結合以形成一可快速滅菌且用于靜脈內投與的穩定、混合膠束制劑 (12)。此混合物的醫藥制劑（通常所說的Esscm_ialcCH&i」postab肺')在其他國家出售分 別用于治療肝病及高血脂癥（12, 15)。
[0009] Rittes首先報道在皮下脂肪注射PBF以減少眶下脂肪疝（1)。此后，醫師已經開 始使用所述醫藥制劑或類似復合PBF來治療下眼瞼脂肪疝出以及大腿、腹部、上背、頦及臂 上的脂肪沉積（2,3,5)。所述PBF通常沒有Esscntialc長及LipostabiKR1中通常所發現的 dl- α -生育酚（維生素 E)、B-維生素及單磷酸酰苷（2, 16)。
[0010] 磷脂酰膽堿調配物伴隨局部燙覺、紅斑、暫時蕁麻疹及不同程度的瘙癢，所有這些 通常在數天內消退。也會出現更嚴重的后遺癥潰瘍及疼痛。已報道在一患者的大腿多次磷 脂酰膽堿注射的部位處出現感染性肉牙反應（7)。增加所注射磷脂酰膽堿的劑量具有與利 用大劑量的Liposmbikfc 口腔及靜脈內調配物所觀察到的相當的副作用且包括惡心、腹瀉、 腹部疼痛及暈厥。 toon] 含磷脂酰膽堿的調配物如何減少皮下脂肪沉積的機制還不為人所知，但已提出若 干機制（4)。首先是磷脂酰膽堿可通過刺激脂肪酶活性減小脂細胞的尺寸。或者，假定所述 PBF起一乳化脂細胞細胞膜的清潔劑作用。清潔劑用于醫療中已有數十年，特定而言，作為 通常用于硬化療法的硬化劑（American College of Phlebology，2003)。清潔劑具有獨特 的極性及非極性化學性質，此有助于通過降低其界面處的表面張力來乳化不溶物質（17)。 實際上，實驗室清潔劑（如Triton.:R X-100及FimpigcrrX BB)通常皆用于使細胞膜的脂質 雙層裂解（10, 18-21)。所述PBF的兩種主要成份磷脂酰膽堿及脫氧膽酸鈉具有所述獨特化 學性質且因此已作為清潔劑或乳化劑單獨使用（9, 18, 20-25)。
[0012] 隨著居民年齡及體重增加，用于改善外表的外科及非-外科程序的普及也增加。 吸脂術是最流行的整容外科程序之一且包括使用抽吸手術去除脂肪沉積且視情況輔以溶 液以幫助脂肪去除。吸脂術也稱為脂肪整復或脂肪抽吸術，其是一種通過皮膚中的一個切 口通過其插入一插管去除脂肪的外科程序。所述插管連接至一抽吸源并通過所述插管將不 期望的脂肪吸出并丟棄。根據欲去除脂肪的數量及位置，吸脂術可在全身或局部麻醉下進 行。
[0013] 此外，吸脂術最常用的形式是使用流體注射方法，其中吸出所述脂肪組織之前將 一含鹽、麻醉劑及血管收縮劑混合物的含藥溶液輸注于所述治療部位。所述含藥溶液有助 于更容易地去除所述脂肪、減少血液損失并提供手術期間及之后的麻醉。
[0014] 在一用于吸脂術的輔助溶液的實例中，1997年4月22日提出申請且于1999年4 月6日以美國專利第5, 891，083號頒予Capella和Capella的美國專利教示吸脂術及含一 用于改善去除皮下脂肪外科程序的化合物的載體溶液。在一實施例中，所述Capella專利 揭示所述化合物是一種酶，尤其是脂肪酶或共脂肪酶。將所述酶添加于一載體（例如鹽水） 溶液中以提供一脂解溶液。在所述發明的另一實施例中，Capella教示也可有利的結合乳 化劑（例如膽汁鹽）或將其作為主要活性化合物添加于所述溶液中。在所述Capella發明 的每一實施例中，所述脂解溶液均是在吸脂之前投與一段時期以使所述溶液滲入所述脂肪 組織。Capella中任何地方均未單獨使用所揭示的脂解溶液作為一非外科方法用于自所述 身體去除脂肪。在Capella中所揭示的所有實例及特定實施例中，吸脂術是作為一種外科 程序用于脂肪去除且脂肪酶和膽汁鹽是作為吸脂的輔助劑來提供。
[0015] 然而，吸脂術及其他去除脂肪的外科方式均伴隨明顯的不良事件，其包括暫時性 皮下出血、腫脹、麻木、酸痛及燙覺、感染風險、色素沉著改變；形成可迀移至肺并造成死亡 的脂肪塊及血塊、導致休克的過度流體損失或必須排出的流體積累、摩擦灼傷或其他對皮 膚及神經的損害或對重要器官的穿孔傷。此外，吸脂術需要1至2周的恢復時間，其中所述 患者不能工作或進行一些日常活動。而且，由于諸如吸脂術等外科程序需要局部或有時全 身麻醉，所以外科去除脂肪伴隨明顯的與麻醉相關的風險。
[0016] 因此，業內希望具有一種去除局部脂肪積累的方法，其不需要外科手術或長恢復 時間且具有比現行方法少的不利副作用。
【發明內容】
[0017] 本發明提供用于減少皮下脂肪沉積的方法及試劑盒。本發明一方面涵蓋具有一第 一容器以及不使用外科手術減少一哺乳動物中皮下脂肪沉積的書面說明的試劑盒，所述第 一容器包含一藥理活性清潔劑及少于5% w/v磷脂酰膽堿。較佳地，本發明所述試劑盒可用 于減少各種哺乳動物（例如，人、馬、狗或貓）的脂肪沉積。在一些實施例中所述哺乳動物 為人類。
[0018] 在一些較佳實施例中，所述第一容器具有小于500ml的總體積及/或作為一可注 射調配物提供。在其他較佳實施例中，所述第一容器所包含清潔劑的％ w/v大于磷脂酰膽 堿的％ w/v或可不包含磷脂酰膽堿。在一較佳實施例中，本發明以大于其臨界膠束濃度 (CMC)的濃度提供清潔劑。所述試劑盒可包含各種藥理活性清潔劑，例如，一親脂性清潔劑、 親水性清潔劑、離子清潔劑、非離子清潔劑、甘油酯、膽汁鹽及兩性離子清潔劑。在一更佳實 施例中，所述活性清潔劑是一種膽汁鹽，更佳為脫氧膽酸鈉。在一些實施例中，本發明所述 試劑盒中的第一容器可包括少于3g的清潔劑。在其他實施例中，本發明所述試劑盒中的第 一容器可包括多于0. 0002g的清潔劑。在任何本發明實施例中，所述第一容器均可進一步 包含一第二清潔劑。
[0019] 較佳地，所述第一容器可進一步包含一第二治療劑，例如，抗微生物劑、血管收縮 劑、抗血栓形成劑、抗凝劑、抑泡劑、消炎劑、鎮痛藥、分散劑、抗分散劑、滲透增強劑、類固 醇、鎮靜劑、肌肉松弛劑及止瀉劑。在一些實施例中，所述第二治療劑是一種鎮痛藥、抗微生 物劑或消炎劑。更佳地，所述第二治療劑是一種鎮痛藥或最佳為利多卡因（lidocain)在另 一實施例中，所述試劑盒提供一包含本文所述第二治療劑的第二容器。
[0020] 本發明一實施例涵蓋一用于減少一哺乳動物的眼睛、頦或臂下、以及臀部、小腿、 背部、大腿、踝或胃的脂肪沉積的本文試劑盒。在另一實施例中，所述試劑盒可減少特定類 型的脂肪沉積，例如，眼瞼脂肪疝出、脂肪瘤、脂肪營養障礙、水牛背脂肪營養障礙或與蜂窩 組織有關的脂肪沉積。
[0021] 本發明第二方面提供不進行外科手術減少一哺乳動物皮下脂肪沉積的方法，其包 括投與一含有效量的藥理活性清潔劑及少于5% w/v磷脂酰膽堿的單位劑量。在一實施例 中，所述方法不包括主動去除所述清潔劑的步驟。所述方法可用于減少本文所述各種哺乳 動物中的脂肪沉積。
[0022] 在另一實施例中，所述方法包括投與少于500ml溶液的步驟，所述溶液含有效量 的清潔劑及少于5 % w/v磷脂酰膽堿。在一些較佳實施例中，所述單位劑量是局部投與及/ 或重復至少兩次。在其他較佳實施例中，所述單位劑量的清潔劑％ w/v比磷脂酰膽堿的％ w/v大及/或具有濃度高于其CMC的清潔劑。所述方法可使用本文所述各種藥理活性清潔 劑。在一更佳實施例中，所述單位劑量中的所述活性清潔劑是一種膽汁鹽，最佳為脫氧膽酸 鈉。
[0023] 較佳地，本發明所述方法可進一步包括投與一第二清潔劑及/或第二治療劑。所 述方法可包括投與本文所述的各種第二治療劑。更佳地，所述第二治療劑是一種鎮痛藥，最 佳為利多卡因。
[0024] 一其他實施例涵蓋本文所述一或多種減少一哺乳動物眼睛、頦或臂下、以及臀部、 小腿、背部、大腿、踝或胃的脂肪沉積的方法。在另一實施例中，所述方法可減少特定類型的 脂肪沉積，例如，眼瞼脂肪疝出、脂肪瘤、脂肪營養障礙、水牛背脂肪營養障礙或與蜂窩組織 有關的脂肪沉積。
【附圖說明】
[0025] 圖1繪示（a)磷脂酰膽堿（b)脫氧膽酸鈉及（c)芐醇的分子結構。
[0026] 圖2繪示根據本發明教示磷脂酰膽堿膽汁調配物（PC配方，PBF)及脫氧膽酸鈉單 獨對培養細胞存活率的影響：(a) MTS分析，測量單獨暴露于PC配方及脫氧膽酸鈉的角化細 胞存活率；(b)乳酸脫氫酶（LDH)分析，測量單獨暴露于PC配方及脫氧膽酸鈉的細胞釋放 的 LDH。
[0027] 圖3繪示根據本發明教示PBF及脫氧膽酸鈉單獨對豬的主要脂肪組織的影響：(a) MTS分析，在用所述PBS緩沖液（作為陰性對照（-Cont))、單獨脫氧膽酸鈉（DC)、PBF (PC) 及丁riton_:R清潔劑（作為陽性對照（+Cont))處理的脂肪試樣中產生指示活細胞的紫色色 素；(b)不同處理之間脂肪細胞存活率的比較。
[0028] 圖4繪示根據本發明教示用單獨的脫氧膽酸鈉（DC)、PBF (PC)、Triton?猜潔劑（作 為陽性對照（+Cont))及PBS緩沖液（作為陰性對照（-Cont))處理的脂肪試樣中的鈣黃綠 素熒光。
[0029] 圖5繪示根據本發明教示用制得的組合物處理后豬皮膚活組織檢查的光學顯微 鏡方法，其顯示（a)對照脂細胞及（b)注射PBF后的脂細胞（H&E，初始放大率，20倍）；（c) 對照脂細胞及（d)單獨注射脫氧膽酸鈉后的脂細胞（H&E，初始放大率，10倍）；(e)對照肌 肉及（f)單獨注射磷脂酰膽堿后的肌肉（H&E，初始放大率，10倍）；（g)注射Empigen_X?清 潔劑后的脂肪（H&E，初始放大率，20倍）。
[0030] 圖6繪示根據本發明教示用脫氧膽酸鹽注射2天后自一患者去除的脂肪瘤：(a) 大體病理及（b)組織學（H&E，初始放大率，20倍）。
[0031] 圖7繪示一用于減少皮下脂肪積累的試劑盒。
【具體實施方式】
[0032] 本發明通過提供一種非外科方法解決了哺乳動物中局部脂肪積累的問題，所述方 法通過投與在醫藥上可接受的調配物中脂肪溶解濃度的一或多種清潔劑來減少脂肪沉積。
[0033] 根據磷脂酰膽堿在膽汁中起乳化劑作用及其在治療高血脂癥中的用途，假定磷脂 酰膽堿在PBF中作為活性成份（1，2, 21，25, 27)。添加所述先前技術組合物中的清潔劑（例 如膽汁鹽）僅為了分散或溶解所述假定活性成份PC。然而，至今，還沒有公開的報道支持此 理論。本發明者出人意料的證明，所述膽汁鹽實際上是局部脂肪乳化的活性劑。
[0034] 在一個句子末尾括號中出現的數字是指申請專利范圍之前討論本
【發明內容】
時所 列舉的特定參考文獻。出于所有目的，本文所列舉的所有參考文獻均以其全文引用的方式 并入本文中。
[0035] 磷脂酰膽堿是一種天然磷脂，其是細胞膜的主要成份且對于正常細胞膜構成及修 復很重要。磷脂酰膽堿也是主要營養物膽堿的主要遞送形式。膽堿自身是神經遞質乙酰膽 堿、甲基供體甜菜堿及磷脂（尤其包括磷脂酰膽堿及鞘磷脂）合成中的一種前體。磷脂酰 膽堿也包括極低密度脂蛋白的肝輸出物。
[0036] 膽汁鹽已經用于提高磷脂酰膽堿、且最近諸如兩性霉素 Β、ΤηχοΚ?及地西泮 (diazepam)等藥物的水溶性（9-14)。高度純化的磷脂酰膽堿可與次級膽汁鹽脫氧膽酸鈉、 抗微生物劑、芐醇及水結合以形成一可快速滅菌且用于靜脈內投與的穩定、混合膠束制劑 (12)。此混合物的醫藥制劑（通常所說的EssentMe⑩及Li|J〇stabi_)在其他國家出售分 別用于治療肝病及高血脂癥（12, 15)。
[0037] 醫師已經開始使用所述醫藥制劑或類似復合PBF來治療下眼瞼脂肪疝出以 及大腿、腹部、上背、頦及臂上的脂肪沉積（2,3,5)。所述PBF通常沒有EssentialeJi及 Lipostabil·%中通常所發現的dl- α -生育酚（維生素 E)、B-維生素及單磷酸酰苷（2, 16)。
[0038] 吸脂術是最流行的整容外科程序之一且包括使用抽吸手術去除脂肪沉積且視情 況輔以溶液以幫助脂肪去除。吸脂術也稱為脂肪整復或脂肪抽吸術，其是一種通過皮膚中 的一個切口通過其插入一插管去除脂肪的外科程序。所述插管連接至一抽吸源并通過所述 插管將不期望的脂肪吸出并丟棄。根據欲去除脂肪的數量及位置，吸脂術可在全身或局部 麻醉下進行。所述輸注液由大體積的溶液構成且通常在吸脂程序之前或期間擠出所述患者 體外。參見專利第5, 891，083號。
[0039] 使用吸脂術及/或其他脂肪去除的外科方法均伴隨有明顯的不良事件，其包括暫 時性皮下出血、腫脹、麻木、酸痛及燙覺、感染風險、色素沉著改變；形成可迀移至肺并造成 死亡的脂肪塊及血塊、導致休克的過度流體損失或必須排出的流體積累、摩擦灼傷或其他 對皮膚及神經的損害或對重要器官的穿孔傷。此外，吸脂術需要1至2周的恢復時間，其中 所述患者不能工作或進行一些日常活動。而且，由于諸如吸脂術等外科程序需要局部或有 時全身麻醉，所以外科去除脂肪伴隨明顯的與麻醉相關的風險。
[0040] 盡管獲得了一些成就，但先前技術及組合物也具有一些限制。因此，希望具有一種 減少局部脂肪積累的方法，其不需要外科手術或長恢復時間且具有比現行方法少的不利副 作用。
[0041] 本發明是關于使用一或多種藥理活性清潔劑（例如，膽汁鹽）通過將此調配物局 部投與至一靶部位減少一哺乳動物中皮下脂肪積累。
[0042] 在清潔劑中，膽汁鹽是脂質雙層膜尤其有效的增溶劑（9, 20, 21，23, 28)。所有的生 物細胞膜均由相同的雙分子脂質結構構成，且因此可通過清潔劑增溶（10, 19, 34)。通過一 清潔劑使細胞膜增溶包括所述清潔劑在脂質雙層間的分配、使所述雙層不穩定、分解、且隨 后形成混合膠束（由清潔劑及細胞膜脂質構成）（10, 19, 21)。膽汁鹽及其他清潔劑降低不 混溶材料邊界處的表面張力，且使大凝聚物分解成越來越小的顆粒。在組織中，所述試劑溶 解細胞膜并造成細胞溶解。此產生一炎癥反應，導致身體去除被清潔劑溶解材料。
[0043] 出于此原因，本發明者使用一測量細胞存活率的簡單定量分析來比較脫氧膽酸鈉 與完全PBF(圖2a)。除非磷脂酰膽堿與諸如膽汁鹽等物質結合，否則不溶于水溶液中，所以 不可能分離并測試純的磷脂酰膽堿（12)。磷脂酰膽堿可高度溶于乙醇、甲醇、氯仿及其他有 機溶劑，但這些試劑會破壞脂質雙層（29-31)。在最初試驗中，純的經分離PC及使用乙醇溶 解的PC之間在細胞溶解及組織學方面沒有差別。盡管芐醇（所述PC配方中的一種組份） 已展示影響細胞膜的流動性，但其不是清潔劑，且因此其在所述配方中的有限數量對細胞 膜的溶解效應可忽略（32, 33)。
[0044] 由于至完整組織的滲透可能是一限制因素，所以細胞培養可用于確定所述試劑 (PBF和脫氧膽酸鹽）侵襲細胞所需的稀釋度。脫氧膽酸鹽極大地降低所培養細胞的存活 率，大約等于所述完全PBF (圖2a)。此發現可通過將豬的脂肪暴露于PBF和脫氧膽酸鹽在 組織中再現（圖3)。這些結果支持了脫氧膽酸鈉在所述PBF中扮演一重要有效作用的意想 不到的觀察結果。
[0045] 本發明是基于利用破碎細胞膜的清潔作用來減少皮下脂肪沉積。在所培養的細胞 中膜溶解是使用一乳酸脫氫酶（LDH)分析且在組織中使用鈣黃綠素（在具有完整細胞膜的 細胞中保留的一熒光標記）來測量。所述LDH分析測量LDH的活性，所述LDH是一種當細 胞溶解時所釋放的細胞溶質酶。經所述PBF和脫氧膽酸鹽二者處理的細胞培養物證明在細 胞溶解中一濃度依賴性增加（圖2b)。而且，在用這些試劑處理的培養細胞中所觀察到的直 接溶解效應表明內源性脂肪酶的活性不相關性。在暴露于所述PBF、脫氧膽酸鹽及Triumt X-100(-種習知的實驗室清潔劑）的脂肪試樣中損失鈣黃綠素（圖4)。此發現證明：細胞 膜的破碎出現在暴露于所述PBF及脫氧膽酸鹽二者的新鮮組織中。
[0046] 比較所述PBF對脫氧膽酸鹽在細胞培養中的影響得出令人驚訝的結果：脫氧膽酸 鹽造成類似的細胞存活率損失，但細胞溶解較少。這些差異可濃度有關或其可能是所述配 方中磷脂酰膽堿和脫氧膽酸鹽間的協同效應。盡管如此，所述數據仍然表明：在類似于臨床 所用的濃度下，脫氧膽酸鹽和所述PBF對組織組織學及細胞存活率具有類似影響。將這些 一起考慮，這些數據出人意外的表明：脫氧膽酸鹽在先前技術PBF中起活性成份的作用。
[0047] 為了闡述清潔劑對組織組織學的作用，用PBF、脫氧膽酸鹽及明確的實驗室清潔劑 注射新鮮豬皮膚（圖5)。與PBS注射液（對照）相比，所有試劑均造成脂細胞機體的明顯 破碎。在肌肉及結締組織中同樣觀察到了這些結果。細胞邊界被所述測試物質快速溶解及 其類似于明確的清潔劑的影響證明：所述PBF和脫氧膽酸鹽起清潔劑的作用。此試驗模型 的局限性在于其沒有揭示注射至活組織中后出現的實際后遺癥。臨床報告表明：注射后可 出現強烈的炎癥反應、諸如紅斑及水腫等事件（1-3)。反復的炎癥可能導致纖維化，尤其多 次注射后。已在若干患者中報道纖維化，所述患者投與PBF后在注射部位處產生最終經過 數月后才消除的堅實結節35)。
[0048] 組織學發現揭示：可注射PBF和脫氧膽酸鹽單獨均可造成脂肪及肌肉中的結構破 壞，但對表皮、真皮或附件沒有明顯作用（圖5)。然而，HmpigcnE BB(-種可能的實驗室 清潔劑）對真皮膠原（結締組織）具有深層的組織作用。或者，在所述測試濃度下（類似 于那些在臨床實踐中所用的濃度），脂肪和肌肉對清潔劑處理比那些其他結構更敏感。
[0049] 盡管一系列實驗室試驗利用新鮮的組織試樣及細胞培養物，但本發明者已證明先 前技術PBF通常用于皮下注射中起主要造成細胞膜的非特異性溶解的脂肪溶解作用。細胞 膜是所有組織類型的成份；明確的說，本發明者證明所述清潔劑可使脂肪、肌肉及結締組織 增溶。因此，本發明者得出結論：脫氧膽酸鈉（用于溶解所述磷脂酰膽堿的配方的膽汁鹽成 份）是那些先前技術調配物的主要活性成份。此結論可由藥理活性清潔劑（例如膽汁鹽） 是細胞膜的有效增溶劑這一事實來支持。而且，所述PBF和脫氧膽酸鈉在脂肪溶解中的機 制類似于清潔劑作用。
[0050] 組合物
[0051] 在本發明一實施例中，可生物相容清潔劑的醫藥組合物包括一或多種藥理活性清 潔劑及呈一水性媒劑的醫藥上可接受的賦形劑。特別的是，包括膽汁鹽在內的藥理活性清 潔劑用于溶解脂肪也包括在本發明范疇內。
[0052] 在一實施例中，本發明是關于實質上由一或多種減少皮下脂肪有效量的藥理活性 清潔劑組成的組合物。
[0053] 可用于本發明實施例的藥理活性清潔劑包括（但不限于）親脂性清潔劑、（無論是 離子還是非離子）、親水性清潔劑（無論是離子還是非離子）、離子清潔劑、非離子清潔劑、 兩性離子清潔劑、甘油酯及膽汁鹽。
[0054] 親脂性清潔劑的非限制實例尤其包括醇；聚氧乙烯烷基醚；脂肪酸、膽汁酸；甘油 脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低碳數醇脂肪酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯；聚乙二醇甘油脂 肪酸酯；聚丙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油酯；單/二甘油酯的乳酸衍生物；丙二醇二甘油