Usp33在腫瘤中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及用作腫瘤標志物的USP33及其在制備治療肺 癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 肺癌是最常見的癌癥，每年全球死亡約138萬人，同時其5年生存率約為15%。雖 然目前有眾多的治療手段，包括手術、放療、化療和靶向治療甚至他們之間組合治療，但其 效果都差強人意。肺癌可以分為小細胞肺癌SCLC和非小細胞肺癌NSCLC。非小細胞肺癌， 包括鱗狀細胞癌、腺癌、未分化大細胞癌、腺鱗癌和支氣管腺體癌；小細胞肺癌，由均勻一致 的小細胞構成，典型的呈燕麥樣。NSCLC占到約80%的病例。當前的肺癌的治療主要基于 腫瘤形態學和以腫瘤淋巴結轉移TNM為基礎的分期系統。在肺癌中許多抑癌基因已經被發 現，包括TP53,P16,LKB1/STK11，NF1，RASSF1，APC，BRG1，PTEN和RB。各種易感基因最近也 已被發現，然而，抑制肺癌的侵襲和轉移的內源性機制仍然知之甚少。
[0003] 近期的報道顯示，神經元導向分子被認為與腫瘤的侵襲和轉移過程相關。Slit基 因最初在果蠅中被發現，它的產物是一個分泌蛋白家族，充當神經導向分子的作用。最近的 研究表明slit基因參與不同類型的癌癥細胞的侵染和轉移。Slit蛋白通過與一個單次跨 膜蛋白Roundabout(Robo)的結合實現其功能。調控Slit-Robo信號傳導作用的蛋白之一 是泛素特異性蛋白酶33 (USP33)。作為泛素特異性蛋白酶家族的一個成員之一，USP33最初 發現作為底物的蛋白結合到VHLE3連接酶。在Slit信號通路調控中線部位連合軸突導向 中，USP33被認為是必需的。
[0004] 此外，slit信號在實現其抑制乳腺癌細胞遷移的功能中，USP33也參與其中，這表 明USP33可能在癌癥侵襲和轉移中發揮重要作用。然而，在肺癌中USP33如何調控slit信 號傳導的機制并不清楚。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，提供USP33在肺癌中的應用，特別是USP33在制備 檢測和治療腫瘤藥物中的應用。
[0006] 為解決上述問題，本發明第一方面提供的技術方案是：USP33在腫瘤中的應 用，USP33作為腫瘤預后檢測標志物和USP33在腫瘤藥物開發中的應用。
[0007] 優選地，USP33作為腫瘤預后檢測標志物，所述腫瘤包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和 急性髓細胞白血病。
[0008] 優選地，USP33在制備腫瘤藥物中的應用，所述腫瘤為肺癌。
[0009] 優選地，USP33作為腫瘤治療靶點。
[0010] 優選地，USP33通過調控slit-Robo信號通路抑制腫瘤細胞轉移。
[0011] 本發明第二方面提供一種診斷試劑盒，該試劑盒含有檢測USP33蛋白物質，所述 USP33蛋白序列為SeqNo. 1。
[0012] 本發明第三方面提供一種試劑盒，該試劑盒含有檢測USP33基因的物質，所述 USP33基因序列為SeqNo. 2。
[0013] 本發明第四方面提供一種診斷試劑盒的用途，用于檢測腫瘤及腫瘤預后USP33表 達。
[0014] 本發明第五方面提供一種腫瘤藥物組合物，該藥物組合物含有：USP33基因和/或 其編碼的蛋白，以及醫學上可接受的藥用輔料。
[0015] 優選地，所述腫瘤為肺癌。
[0016] 在這項研究中，發明人證明Slit蛋白抑制肺癌細胞的遷移過程需要USP33參與。 USP33調節肺癌細胞中Robo受體的水平。這與USP33在神經元和非癌細胞的作用方式有著 明顯的差別（Yuasa-Kawadaetal.，2009a，b)。此外，USP33在肺癌細胞中扮演腫瘤抑制劑 的角色，因為USP33的低表達與肺癌患者的預后較低的生存率呈現很強的相關關系。
[0017] 在肺癌組織中USP33表達顯著下降。高USP33表達與預后較好有關。USP33可以 提高Robol穩定性，并且是slit蛋白抑制腫瘤細胞遷移所必須的。這些發現表明，USP33是 肺癌發生的一個關鍵參與者，有希望作為一個新的肺癌預后標志物。
[0018] 本發明提供的USP33能夠調節肺癌細胞中Robo受體的水平，提高Robol蛋白穩定 性，并且是slit蛋白抑制腫瘤細胞遷移所必須的。因此USP33可以作為治療腫瘤，特別是 肺癌藥物的重要組份，聯合其它抗癌藥物共同用藥。此外，USP33還可以作為肺癌預后檢測 標志物，為腫瘤、特別是肺癌的檢測和治療提供新的方法和方案。
【附圖說明】
[0019] 下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述：
[0020] 圖1顯示了 25組肺癌和非肺癌組織樣本中mRNA的表達水平，Y軸為表達量，GAPDH 基因做參照，***P〈〇. 001。
[0021] 圖2免疫組化染色檢測肺癌和對照樣本中USP33表達情況。其中，a和c為在正 常組織中檢測到USP33表達的強陽性信號，b為腺癌中的USP33陽性表達示例，d為鱗狀細 胞癌USP33陽性表達示例。
[0022] 圖3肺癌樣本（N= 25)和對照正常組織樣本（CTRL)(N= 25)USP33蛋白表達情 況的定量分析。
[0023] 該USP33-免疫組化分數的計算方法如下：USP33免疫組化得分=(陽性腫瘤細 胞的百分比）X染色信號強度。在肺癌中USP33蛋白表達量顯著低于非肺癌組織（**， P<0. 01) 〇
[0024] 圖4從公布的數據庫中經分析發現在肺癌患者樣本中USP33的表達量下降；其中，
[0025] 圖4A為TCGA數據庫肺癌樣本中USP33基因變異及表達情況。淡藍色表示純合性 缺失；綠色表示體細胞突變；粉紅色表示表達上調；藍色表示表達下調。這些結果所依賴的 計算數據來自癌癥CBI0門戶網站((http: //www.oncomine.org).)
[0026] 圖4B為TCGA數據庫肺癌樣本中USP33氨基酸突變情況。
[0027] 圖4C為利用Oncomine(http://www.oncomine.org).分析五組數據庫中肺癌患者 USP33基因的表達水平。在五組數據庫中，肺癌樣本與非腫瘤樣本相比，USP33的表達量發 生明顯下降。LUAD:肺腺癌；LuSC:肺鱗狀細胞癌，Ctrl:對照。
[0028] 圖5為不同組織樣本中USP33基因表達變化情況。
[0029] 圖6顯示了不同癌癥數據庫中顯示低表達USP33基因意味著較短的生存期；具體 如下
[0030]圖 6A為TCGA肺癌數據庫AgilentG4502A_07_3 數據，USP331ow中n= 91，USP33high中n= 91;P= 0? 0436，
[0031]圖 6B為TCGA肺癌數據庫IlluminaHiSeq_RNASeqV2 數據，USP331ow中n= 106,USP33high中n= 106;P= 0? 0267，
[0032]圖6C為 GSE3141肺癌數據庫中的數據是通過 KM(http://kmplot.com/analysis/) 進行分析。USP331ow中 n=28,USP33high中 n=83;P=0? 031，
[0033] 圖6D為GSE31210肺癌數據庫中的數據是通過KM(http://kmplot.com/ analysis/)進行分析。USP331ow中n= 113,USP33high中n= 113;P= 0? 034，
[0034]圖 6E為TCGA肺癌數據庫USP331ow中n= 61，USP33high中n= 61;P= 0? 0188，
[0035]圖 6F為肺癌數據庫利用 KM分析USP331ow中n= 562,USP33high中n= 553;P =0? 034，
[0036]圖 6G為TCGA黑色素瘤數據庫USP331ow中n= 145,USP33high中n= 50;P= 0.0453，
[0037] 圖6H為TCGA急性髓細胞白血病數據庫，USP331ow中n= 77,USP33high中n= 82;P= 0? 0282。
[0038] 圖7A和7B分別為H1299細胞在轉染siRNA或siUSP33后用對照或slit蛋白處理 之后圖片及計數分析圖，在第三天和第四天對照組和slit處理組細胞數量沒有明顯變化。
[0039] 圖8為USP33通過泛素化催化位點調節slit抑制肺癌細胞轉移；其中，圖8A為轉 染對照siRNA或siUSP33的H1299cells傷口愈合實驗圖片；圖8B和圖8E表示細胞遷移距 離。圖8C顯示了Western試驗證明是siUSP33而不是對照siRNA可以抑制USP33基因在 H1299細胞中的表達。圖8D為野生型USP33或突變USP33(C163A)被用于安慰對照或slit 對照。產生劃痕后，邊緣的細胞將會朝右側運動，圖形在劃痕后不同時間點采集，白色點狀 線表示0小時傷口邊緣。圖8F為Western驗證USP33野生型和突變基因（C163A)在H1299 細胞中表達。
[0040] 圖9顯示了 USP33與Robol相互作用，并影響Robol在肺癌細胞中的穩定性。其 中，圖9A在H1299細胞中USP33與Robol的相互作用。在對照和slit組中利用對照IgG 或Robol抗體開展免疫共沉淀實驗。免疫沉淀獲得的蛋白利用USP33抗體進行Western blotting檢測，
[0041] 圖 9B顯示了對轉染Robo-HA,Flag-ubiquitin,CtrlsiRNA或siUSP33 的H1299 進行去