草分枝桿菌口服納米粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體涉及草分枝桿菌口服納米粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 草分枝桿菌系多功能免疫增強劑，它的主要成分是滅活的草分枝桿菌，對人類是 一種非病源性細菌，主要通過免疫應答反應調節機體免疫功能，從而起到治療的目的。草分 枝桿菌的細胞壁成分誘導非特異性免疫刺激和放大作用，進入人體后，激活了機體的免疫 系統，達到治療效果。草分枝桿菌主要可分為體液免疫、細胞免疫、巨瞻細胞作用H種方式 (朱慕云等，草分枝桿菌在腫瘤臨床應用中的價值，2008,P357)。對體液免疫的作用主要體 現在增強效應T細胞活性，促使效應T細胞分泌B細胞生長因子，刺激B細胞進入增殖、分 化階段，最終促進特異性抗體形成，臨床表現為血清IgG、IgM滴度的增高。對細胞免疫的 作用體現在草分枝桿菌能顯著增強特異性細胞免疫功能，促進淋己細胞轉化、增殖，促進白 細胞介素2、白細胞介素4、腫瘤壞死因子、Y干擾素等各種細胞因子的產生，還可顯著增強 自然殺傷細胞活性。對巨瞻細胞的作用體現在草分枝桿菌能刺激T淋己細胞，促使其釋放 巨瞻細胞移動抑制因子、巨瞻細胞凝集因子、巨瞻細胞趨化因子、促有絲分裂因子等，促進 單核2巨瞻細胞釋放大量氧自由基，促進骨髓多能干細胞和脾粒細胞及巨瞻細胞的前體增 殖，增加白細胞介素1的分泌，最終殺滅病原體。
[0003]目前臨床使用的草分枝桿菌為注射液，商品名為"烏體林斯"，臨床采用深部肌肉 注射給藥。注射后少數病人可能會出現疲倦、咳姨較多或發熱等癥狀，部分患者局部甚至可 能出現肌肉組織壞死，可通過纖維化進行修補，最后形成硬結，但是愈合后在劇烈運動過程 可出現疼痛。其次，與口服藥物相比，注射藥品風險較高，發生不良反應的幾率大，而且對生 產過程的控制嚴格，造成成本較高。因此，有必要開發口服的草分枝桿菌制劑避免上述弊 玉山 乂而。
[0004] 發明人也嘗試將草分枝桿菌直接制成口服制劑使用，但是發現并無預期的免疫增 強作用。參考現有資料（王運芳等，舌下含服烏體林斯治療兒童反復呼吸道感染，中華兒科 雜志，2000,P179)中提及的舌下含服注射液，利用送種給藥方式藥物能很快被吸收，直接 進入血液循環，并且避免肝臟的首過效應，不過由于舌下粘膜吸收面積有限，草分枝桿菌用 量劑量較小，而且需要考慮草分枝桿菌對口腔粘膜的刺激性和藥物本身的異味，因此有必 要開發草分枝桿菌的口服制劑。發明人發現，一般的口服制劑會破壞草分枝桿菌的藥效，造 成上述原因是因為草分枝桿菌進入胃腸道后會被胃部的消化酶直接分解，因而無法吸收進 入體內血液循環發揮療效。
【發明內容】
[0005] 本發明所解決的技術問題是提供一種草分枝桿菌口服納米粒，本發明納米粒采用 包裹技術將草分枝桿菌包裹在載體材料內部，口服給藥后可W避免胃腸道消化酶對草分枝 桿菌的降解，在藥物到達腸道后，通過腸道淋己結的吸收，進一步被巨瞻細胞吞并，釋放出 藥物草分枝桿菌達到治療效果。
[0006] 具體的，本發明草分枝桿菌口服納米粒是將已滅活的草分枝桿菌制備成平均粒徑 在lOOnm~1ym的口服納米粒。
[0007]納米粒口服后其主要吸收部位在回腸內集合淋己結（P巧er'Spatches,PP)，功 能細胞為微皺權細胞（Micro化IdCells，M細胞）。納米粒被吞瞻后，通過囊性轉運方式轉 運到M細胞基底面凹腔釋放出來，此時納米粒或W游離狀態，或W被巨瞻細胞吞瞻的狀態， 隨淋己細胞通過淋己管從淋己循環進入血液循環，再分布到各組織器官而發揮療效。PP的 M細胞吞瞻在腸道粘膜上皮屏障上打開了一個理想通道，構成了納米粒非受體轉運的主要 生理途徑。在送一過程中，納米粒是W完整結構形式被淋己結內上皮細胞（M細胞）吞瞻， 再被傳遞給抗原遞呈細胞（APC)，最終導致機體產生免疫應答，生成大量分泌型免疫球蛋白 A(sIgA)，送有效地避免了胃腸道消化酶對蛋白質的降解和肝臟對藥物的首過效應，對在胃 腸道中不穩定藥物和抗癌藥的定向淋己系統有著重要的臨床意義。同時，胃腸道粘膜組織 對粒子的吸收有粒徑大小依賴，粒徑較小的納米粒可W更有效地通過PP組織和其它腸系 淋己組織進入血液循環。
[0008] 本發明草分枝桿菌口服納米粒的制備方法包括如下步驟：
[0009]A、將載體材料溶于有機溶劑中，形成有機相；
[0010] B、將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相中，形成初乳；
[0011] C、將初乳逐滴加入水相中，形成復乳；
[0012] D、揮發復乳中的有機溶劑，離必收集固體物質，用蒸傭水洗涂，干燥后即得草分枝 桿菌口服納米粒。
[0013]采用W/0/W復乳溶劑蒸發法來制備草分枝桿菌口服納米粒，其中中間體載體材料 多選擇疏水性物質，步驟A所述載體材料為聚居基己酸、聚乳酸、聚乳酸-居基己酸共聚物、 聚丙帰酸樹脂II、氨化磯脂醜膽堿，載體材料優選聚乳酸-居基己酸共聚物。所述溶劑為甲 醇、丙麗、己酸己醋、二氯甲焼、己酸己醋-二氯甲焼溶液、丙麗-二氯甲焼溶液、丙麗-己醇 溶液，溶劑優選為二氯甲焼。
[0014] 所述有機相是將載體材料溶于溶劑所得，其中，有機相的溶液濃度為20mg/mL~ 130mg/mL，W30mg/mL最優。
[0015] 注：二氯甲焼簡稱為DCM，聚己帰醇簡稱為PVA，聚乳酸-居基己酸共聚物簡稱為 PLGA，聚居基己酸簡稱為PLG，聚乳酸簡稱為PLA。
[0016] 為了延長草分枝桿菌口服納米粒在胃腸道壁或胃腸道特定吸收部位的接觸和轉 運時間，從而促進納米粒的吸收，外水相采用聚己帰醇PVA等乳化劑或粘附性較強的殼聚 糖等溶液，步驟C所述水相為聚己帰醇水溶液、甲基纖維素水溶液、泊洛沙姆188水溶液、藏 糖水溶液或殼聚糖稀醋酸溶液；水相W殼聚糖稀醋酸溶液最優。其中，殼聚糖稀醋酸溶液的 濃度為 2mg/mL~6mg/mL,W3mg/mL最優。
[0017] 步驟B所述形成初乳采用下述方法制備；W初乳的粒徑和多分散系數作為指標， 用不同的方法形成初乳，初乳的粒徑小于900nm時利于復乳的分散。本發明宜采用超聲法 或高速剪切分散乳化法制備初乳。W超聲法形成初乳方法最優，功率范圍200W~500W，超 聲時間30s~lOmin，W450W超聲5min最優。
[001引 如；
[0019] 采用超聲法制備初乳
[0020] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相溶液中，超聲形成初乳，再將初乳逐滴加入水 相溶液中，W450W超聲lOmin形成復乳，150巧m攬拌過夜使有機溶劑完全揮發，15000巧m 離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝桿菌口服納米粒。
[0021] 采用高速剪切分散乳化法制備初乳
[0022] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相溶液中，高速剪切分散儀2500化pm分散2min 形成初乳，再將初乳逐滴加入水相溶液中，W450W超聲lOmin形成復乳，150巧m攬拌過夜使 有機溶劑完全揮發，15000rpm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草 分枝桿菌口服納米粒。
[0023]W初乳的粒徑和多分散系數作為指標，發現W超聲法形成初乳方法最優，功率范 圍200W~500W，超聲時間30s~lOmin，W450W超聲5min最優。
[0024] 步驟C所述形成復乳采用下述方法制備；W口服納米粒最終產品的粒徑、多分散 系數和包封率作為指標，用不同的方法形成復乳。口服納米粒的粒徑較小時，在吞瞻細胞 的作用下可穿過腸壁，分布于回腸內集合淋己結、腸系膜淋己結等免疫器官；多分散系數 小于0.3時體系較穩定；包封率越大，則可W降低藥物的泄漏。本發明宜采用超聲法、高 速剪切分散乳化法、高壓均質法制備復乳。W高壓均質法形成復乳方法最優，均質壓力為 30化ar~ISOObar,循環次數為6~12次，最優為50化ar循環9次。
[00巧]女口：
[0026] 采用超聲法制備復乳
[0027] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，W450W超聲lOmin形成復乳，150巧m攬拌過夜使有機溶劑完全揮發， 1500化pm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝桿菌口服納米 粒。
[0028] 采用高速剪切分散乳化法制備復乳
[0029] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，高速剪切分散儀2500化pm分散5min形成復乳，150rpm攬拌過夜使有機 溶劑完全揮發，ISOOOrpm離必30min收集，用蒸傭水洗涂離必3次，真空干燥后即為草分枝 桿菌口服納米粒。
[0030] 采用高壓均質法制備復乳
[0031] 將草分枝桿菌溶液逐滴加入有機相溶液中，450W超聲5min形成初乳，再將初乳逐 滴加入水相溶液中，高壓均質機30化a