一種脫細胞生物羊膜及種以及京尼平交聯脫細胞生物羊膜的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及脫細胞生物羊膜和京尼平交聯脫細胞生物羊膜的制備方法。
【背景技術】
[0002] 羊膜是胎膜的最內層，屬于生物膜中的一種，是一類天然細胞外基質類生物 衍生材料。羊膜由滋養細胞層分化而來，表面光滑，半透明，有韌性及彈性，厚度為 0. 02-0. 50mm，主要由I、III型纖維膠原蛋白構成，含有少量的VI、V型膠原，其中含有多種 生長因子，如成纖維細胞生長因子_2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)、轉移生長因 子-0(transforminggrowth-0，TGF-0)、促進血管生成的血管內皮生長因子（VEGF)，還 含有纖維連接蛋白（fibr〇nectin，FN)等。羊膜不表達HLA-A、B、C及DR抗原或(62微球蛋 白，透明且無血管、淋巴和神經組織，其抗原性遠低于普通組織。大量研究表明，羊膜具有良 好的細胞相容性和組織相容性，并具有部位特異的組織再生能力，為一新型的生物衍生材 料。
[0003] 羊膜作為生物材料應用于基礎及臨床已經有多年的歷史。早在20世紀初期就有 用含羊膜的胎膜供體移植于燒傷和潰瘍創面的報道，隨后在顱腦外科、腹腔外科、婦產科及 眼科均有其應用的報道。具體來說其主要用途有：①用于眼睛表面疾病如角膜修復、先天性 青光眼、角膜潰瘍等；②用于修補鼓膜損傷；③用于外科手術后預防粘連；④用于燒傷后表 面覆蓋等。
[0004] 然而，羊膜存在細胞殘留、機械性能不足以及降解周期較短等缺陷，限制了其臨床 應用范圍。根據臨床報道，由于羊膜細胞的存在，在眼科，羊膜植片可能會發生植片排斥反 應、植片脫落、移位溶解、感染等并發癥，其安全性存在一定的風險。此外，羊膜較薄，抗拉強 度不足，抗張力強度弱，降解時間較快等，不能用于需要承受一定力學負荷的組織缺損的修 復，如各種類型的胸壁、腹壁缺損（外傷性缺損、先天性缺損、醫源性缺損等）；管道器官部 分缺損（尿道、膀胱、輸尿管、食管、膽管、腸穿孔、血管等）；周圍神經缺損；韌帶缺損等。因 此，有必要對羊膜進行脫細胞處理，以降低其免疫原性，同時，采用適當的方法對羊膜進行 改性處理，既能改善去抗酶解性能，增強其機械性能，又能保持其生物活性，以滿足更多的 臨床需求。
[0005] 現在對生物源材料常用的改性措施有化學法，物理法等。化學法改性常用戍二醛、 碳化二亞胺、順丁稀二酸酐等，其殘留物均有一定組織毒性，為盡可能減少其殘留量，必然 會增加生產成本，不是最好選擇。物理法主要采用紫外光、射線、微波等，雖然無毒無害，但 生產過程中難以控制其時間及強度，難以控制其改性質量。近幾年新出現的化學交聯劑京 尼平（Genipin，CASN0:6902-77-8)，是梔子苷經(6-葡萄糖苷酶水解后的產物，是一種優 良的天然生物交聯劑，可對生物源材料如膠原、殼聚糖、玻璃酸鈉、蛋白、明膠等進行改性處 理，其毒性遠低于戊二醛和其他常用化學交聯劑。而能提高拉伸強度，增強其生物活性，有 利于組織再生愈合，生物相容性改善。
[0006] 王嵐等，"京尼平交聯羊膜的制備及其體外性能研究"，第三軍醫大學學報2012年 2月28日第34卷第4期報道了一種用京尼平交聯羊膜的方法，該方法可以在一定程度上 提高其抗酶解性能和力學性能，但是提高程度有限，其在第2周的降解率為34. 93%，在第4 周降解率就高達74. 62%。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述問題，本發明提供了一種京尼平交聯脫細胞生物羊膜的制備方法。
[0008] 本發明京尼平交聯脫細胞生物羊膜的制備方法，包括如下步驟：
[0009] a、制備脫細胞生物羊膜：
[0010] (1)取羊膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡22~24h，所述混合溶液中甲醇與氯仿的 體積比為1:1~1:3,純化水或去離子水清洗；
[0011] (2)用0? 5~1 % (w/v)十二烷基硫酸鈉溶液浸泡22~24h，純化水或去離子水清 洗；
[0012] (3)用0? 25~0? 5% (w/v)胰蛋白酶溶液消化22~24h，純化水或去離子水清洗。
[0013] b、取步驟a制備的脫細胞生物羊膜，浸泡于濃度為0. 2%~1%的京尼平溶液中， 35~40°C恒溫下作用0. 5~72h，純化水或去離子水清洗；
[0014] c、病毒滅活，純化水或去離子水清洗，真空冷凍干燥，即可。
[0015] 步驟（1)中，所述混合溶液中甲醇和氯仿的體積比為1:1 ;所述浸泡的時間為24h。
[0016] 步驟（2)中，所述十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為0.5% (w/v);所述浸泡的時間為 Mh0
[0017] 步驟（3)中，所述胰蛋白酶溶液的濃度為0? 25% (w/v);所述消化時間為24h。
[0018] 步驟（1)、⑵和（3)中，純化水和去離子水清洗的次數為3次。
[0019] 步驟b中，京尼平溶液的濃度為0. 4%。
[0020] 步驟b中，所述京尼平溶液是含有京尼平的的枸櫞酸一磷酸氫二鈉緩沖液，其pH 為4. 0 ;或者含有京尼平的磷酸鹽緩沖溶液，其為pH7. 4。
[0021] 步驟b中，溫度為40°C;作用時間為24h;純化水和去離子水清洗的次數為3次。
[0022] 步驟c中，病毒滅活采用過氧乙酸（0? 18% )_乙醇（4. 8% )混合溶液浸泡滅活， 滅活時間為4~72h，優選24h。
[0023] 本發明還提供了前述方法制備的京尼平交聯脫細胞生物羊膜。
[0024] 本發明通過特定的脫細胞處理結合特定的交聯方法，制備得到了抗酶解性能優 良、力學性能優良的京尼平交聯脫細胞生物羊膜，其在第15天時仍然未降解，在60天時尚 未完全降解，克服了羊膜存在細胞殘留、機械性能不足以及降解周期較短的缺陷，臨床應用 前景良好。
[0025] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內 容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0026] 圖1未交聯的脫細胞生物羊膜（X10000)
[0027] 圖2京尼平交聯脫細胞生物羊膜（X10000)
[0028] 圖3京尼平交聯脫細胞生物羊膜（橫切面，X400)
[0029] 圖4京尼平交聯脫細胞生物羊膜（縱切面，X400)
[0030] 圖5成纖維細胞接種于京尼平交聯脫細胞生物羊膜培養1天后HE染色，細胞呈梭 形（X100)
[0031] 圖6京尼平交聯前后脫細胞生物羊膜外觀圖片。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1本發明京尼平交聯脫細胞生物羊膜的制備
[0033] 一、制備方法
[0034] 1、脫細胞生物羊膜的制備
[0035] 取健康產婦胎盤，從胎盤上剝取羊膜，0.9 %生理鹽水多次浸泡清洗，除去血液成 分，純化水或去離子水清洗3次，甲醇：氯仿（1 :1)混合溶液浸泡脫脂24h，純化水或去離 子水清洗3次，0. 5 %十二烷基硫酸鈉（SDS)浸泡去垢24h，純化水或去離子水清洗3次， 0. 25%胰蛋白酶消化脫細胞24h，純化水或去離子水清洗3次。
[0036] 2、脫細胞生物羊膜的京尼平交聯處理
[0037] 將脫細胞生物羊膜浸泡于京尼平濃度為0. 4%，溶劑為pH4. 0的枸櫞酸一磷 酸氫二鈉緩沖溶液中，40 °C恒溫下作用24h，純化水或去離子水清洗3次，過氧乙酸 (0. 18 % )-乙醇（4. 8 % )混合溶液浸泡病毒滅活24h，純化水或去離子水清洗3次，真空冷 凍干燥，裁切包裝，輻照滅菌。
[0038] 二、檢測成品檢測
[0039] 3. 1電鏡掃描
[0040] 將待觀察的羊膜樣品置于2. 5%戊二醛磷酸緩沖液（pH7. 2左右）中，于4°C冰箱 中固定過夜。次日以0. 15%的同一緩沖液沖洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分別依 次脫水，每次15min，脫水后，用醋酸戊脂置換乙醇。采用常規的二氧化碳臨界點干燥，干燥 結束后，將樣品放在真空鍍膜機內，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進行觀 察。
[0041] 掃描結果顯示，未交聯的脫細胞生物羊膜保持了天然的膠原蛋白三維網狀支架結 構（圖1)，京尼平交聯后的脫細胞生物羊膜同樣保持了天然的膠原蛋白三維網狀支架結 構，但纖維連接更為致密（圖2)。
[0042] 3. 2細胞殘留檢測
[0043] 采用常規的HE組織學病理切片對京尼平交聯脫細胞生物羊膜進行檢測，結果顯 示，羊膜的橫切面（圖3)和縱切面均未見細胞殘留（圖4)。
[0044] 3. 3機械性能測定
[0045] 拉伸強度、斷裂伸長率、彈性模量的測定采用濟南蘭光機電技術有限公司生產 的XLW(PC)智能電子拉力試驗機，使用50N傳感器，速度25mm/min，羊膜試樣的尺寸為 IcmX4cm〇
[0046] 表1機械性能測定結果
[0047]
[0048] 測定結果顯示，京尼平交聯羊膜組的拉伸強度為（I. 6043±0. 0579)MPa，斷裂伸長 率為（28. 975±3. 0903) %，彈性模量為（0. 0053±0. 0003)GPa，與未交聯的脫細胞生物羊 膜（0? 8003±0. 041)MPa, (16. 181±2. 6808) %，（0? 0033±0. 0002)GPa相比，三者均明顯增 加（P< 0? 05)。
[0049] 3. 4溶脹率測定
[0050] 溶脹率反映了材料吸水膨脹的性能，材料的網絡交聯程度越高，溶脹率越小。
[0051] 在室溫下，將京尼平交聯脫細胞生物羊膜（2〇11