一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及龍眼加工技術領域，尤其涉及一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 龍眼又稱桂圓，是我國南方亞熱帶特色水果，具有藥食兩用功效。龍眼的益智功能 在《本草綱目》、《滇南本草》等我國古代醫藥書上已早有記載，現代醫學研究表明多糖是龍 眼果肉的主要活性成分，表現出抗氧化、免疫調節、改善記憶功能等多重生物活性。
[0003] 多糖的傳統提取方法以熱水浸提為主，隨著天然產物分離純化技術的不斷發展， 酶解和超聲波等技術已廣泛用于植物活性多糖的提取分離，然而這些方法存在耗時長、能 耗高、雜質含量高及提取率低等缺陷。超高壓技術是近年來發展較快的一種新型加工技術， 通過使得細胞內外形成巨大的壓力差，造成細胞破裂，釋放出有效成分，具有操作簡單、時 間短、雜質含量少及環保等優點。目前已經被應用于植物有效活性成分的提取，包括黃酮、 皂苷、生物堿及多酚類物質。近年來，已有植物活性多糖的超高壓提取工藝方面的報道，如 申請號為201310676570. 8的專利公開了一種超高壓提取松茸多糖的工藝。
[0004] 植物蛋白多糖是具有生物活性的大分子，和細胞壁上的纖維素結合在一起，結構 緊密，單純采用超高壓技術不能有效的對多糖進行提取，而且提取出來的蛋白多糖的不存 在改善記憶的功能，本發明采用超聲波-酶協同前處理結合超高壓提取龍眼蛋白多糖，可 以用作特殊醫學用途食品的配料，為龍眼的精深加工提供了新途徑，對推動我國龍眼產業 的健康發展具有十分中藥的意義。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種高提取率且具有改 善記憶功能的龍眼蛋白多糖的制備方法。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明采用如下方案實現： 一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法，對龍眼干依次進行超聲波_酶協同 前處理、超高壓處理、乙醇分步沉淀處理和冷凍干燥處理后制得龍眼蛋白多糖。
[0007] 超高壓提取技術是一種新型的加工技術，具有快速、高效、耗能小、提取溫度低等 特點，已被廣泛應用到物料中有效成分的提取，但是經過發明人的試驗，雖然利用超高壓提 取技術也能進行提取，但是其提取率較低，并且在隨后的小鼠實驗中，通過超高壓提取技術 提取得到的龍眼蛋白多糖，其并沒有改善小鼠的記憶功能障礙，經過發明人的進一步探究， 在進行超高壓處理前，結合超聲波-酶進行前處理后，再通過超高壓提取，不僅僅大幅度的 提高了龍眼蛋白多糖的提取率，而且能顯著改善小鼠的記憶功能障礙。
[0008] 更具體的步驟如下： Si.超聲波-酶協同前處理：龍眼干加水打漿，將漿液置于超聲場中同時添加復合酶進 行處理，得酶解液； 52. 超高壓處理：對步驟SI中的酶解液進行超高壓處理得龍眼液； 53. 乙醇分步沉淀處理：對步驟S2中的龍眼液過濾后濃縮，于濃縮液中加入乙醇進行 分步沉淀； 54. 冷凍干燥處理：將步驟S3中的沉淀進行真空冷凍干燥，得龍眼蛋白多糖。
[0009] 步驟Sl中，水的添加量為龍眼干重量的10~40倍，所述復合酶為纖維素酶和木 聚糖酶，纖維素酶的添加量為龍眼干重量的〇. 2~0. 6%，木聚糖酶的添加量為龍眼干重量的 0. 1~0. 5%，超聲波功率為200~400w。
[0010] 通過纖維素酶和木聚糖酶結合超聲波進行前處理，再進行超高壓處理，正是通過 這兩種方式的結合，使得最終提取出來的龍眼蛋白多糖具有顯著的改善記憶功能，而且發 明人在確定這兩種方式后，通過進一步的優化，采用了纖維素酶和木聚糖酶，并在合適的用 量和酶解條件下，提高最終的龍眼蛋白多糖提取率。
[0011] 步驟Sl中，調整漿液pH為5.0~6.8,于溫度為35~50°C下處理10~30min。
[0012] 步驟S2中，超高壓壓力為200~500Mpa，處理時間為3~15min。
[0013] 步驟S3中，將過濾后的龍眼液濃縮汁1/4體積。
[0014] 步驟S3中，于濃縮液中加入乙醇進行分步沉淀具體為：于濃縮液中加入95%乙醇 至最終乙醇的體積百分比為30%，在3~6°C下靜置8~12h后過濾去掉沉淀，向上清液中繼續 加入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為80%，并在3~6°C下靜置8~12h后離心得沉淀。這 一步驟中，分為兩次沉淀操作，通過舍棄第一次得到的沉淀，并且將第二次沉淀操作中乙醇 的濃度定位至80%，這使得最終提取出來的蛋白多糖具備顯著的改善記憶功能。
[0015] 于轉速為4000r/min的條件下離心5~10min。
[0016] 步驟S4中，真空冷凍干燥具體為：于-60~-20°C冷凍干燥20~48h得龍眼蛋白多 糖。
[0017] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果： 1. 本發明通過超聲波-酶處理與超高壓處理結合，使得制備出來的龍眼蛋白多糖具有 顯著的改善記憶功能； 2. 本發明全套工藝簡單，操作方便，所得產品品質穩定，可用作特殊醫學用途配方食品 的配料，同時也提高了龍眼的附加值，為其他藥食兩用植物資源食品的精深加工提供了指 導。
【具體實施方式】
[0018] 為了讓本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面對本發明作進一步 闡述。
[0019] 實施例1 一、龍眼蛋白多糖的制備 一種具有改善記憶功能龍眼蛋白多糖的制備方法，包括如下步驟： Si.超聲波-酶協同前處理：于100g龍眼干添加其重量10倍的水進行打漿，將漿液置 于200W功率的超聲場中，同時添加纖維素酶和木聚糖酶，纖維素酶的添加量為龍眼干重量 的0. 2%，木聚糖酶的添加量為龍眼干重量的0. 1%，調整漿液的pH為5. 0,于溫度為35°C下 處理IOmin得酶解液； 52. 超高壓處理：將步驟SI中的酶解液于壓力為200Mpa的條件下處理3min得龍眼 液； 53. 乙醇分步沉淀處理：將步驟S2中的龍眼液過濾后濃縮至1/4體積，于濃縮液中加 入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為30%，在3°C下靜置8h后過濾去掉沉淀，向上清液中 繼續加入95%乙醇至最終乙醇的體積百分比為80%，并在3°C下靜置8h后離心得沉淀； 54. 將S3得到的沉淀于-60°C冷凍干燥20h得龍眼蛋白多糖。
[0020] 經測試，龍眼蛋白多糖的提取率為14. 1%。
[0021] 二、動物實驗 1、試驗條件 I. 1樣品 本實施例1的龍眼蛋白多糖粉末。
[0022] 1.2實驗動物 KM小鼠，雄性，體重20~25g，SPF級，由南方醫科大學實驗動物中心提供。小鼠于實驗 前7d置于實驗室適應環境，溫度23±2°C，濕度為50~60%，自由飲食、攝水。
[0023] L3分組及處理 (1)分組 KM小鼠60只，適應性喂養1周后隨即分為5組，每組12只，包括對照組、模型組和3 個龍眼蛋白多糖劑量組。對照組和模型組灌胃0.9%生理鹽水，龍眼蛋白多糖組按低劑量 100mg/kg、中劑量200mg/kg、高劑量300mg/kg灌胃給藥，連續給藥28天，在最后一次給藥 Ih后，除對照組腹腔注射生理鹽水外，其它組均腹腔注射東莨菪堿（3mg/kg b.w.)，并于注 射20min后進行明暗箱避暗實驗。
[0024] (2)明暗箱實驗 被動回避實驗時利用動物的好暗避光（明暗穿梭)、對厭惡刺激(如足電擊）的恐懼和 記憶而建立起來的。避暗系統包括兩個等大（20. 3cm*15. 9cm*21. 3cm)的隔室，一個為明 箱，一個為暗箱，明室上蓋對應有LED燈，暗室上蓋對應有一紅外探頭，兩室之間由一個 拱門（8. 9cm*ll. 4cm)相連，門可由實驗需要關閉或打開。隔室地板為不銹鋼柵欄(直徑 3. 175_)。暗箱一側的柵欄地板與刺激器相聯，并可給予電擊；明箱一側則不與電擊相連， 故沒有電流通過。實驗分為電擊刺激訓練和記憶保持測試兩部分。
[0025] 小鼠灌胃第26天起，連續2天在同一時間將小鼠放入明暗箱(不通電）中適應3 min。第28天腹腔注射東莨菪堿20min后開始測試訓練（0 h)，將小鼠背對拱門放入明箱 后，給暗室不銹鋼柵欄通以〇. 4mA電流，小鼠一進入暗室即受電擊后回到明室，此為訓練過 程，記錄小鼠第一次被電擊的時間。分別于測試訓練24 h和48h后對小鼠進行記憶測驗， 將小鼠放入明箱，記錄小鼠第一次進入暗室的時間，此為避暗潛伏期，5 min內未進入暗室 的小鼠其潛伏期按300s計算。
[0026] (3)樣品處理及分析 記憶測試試驗結束后，立即乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，取血后迅速于冰上斷頭取腦， 用4°C預冷的生理鹽水漂洗除去血液，吸干多余水分，加9倍重量的冰生理鹽水，用高速 分散勾衆機制成10%的組織勾衆，3000r/min 4°C離心10min，取上清液，分析其中乙酰膽 堿轉移酶（ChAT)和乙酰膽堿酯酶（TChE)的含量。
[0027] I. 4數據分析 采用SPSS進行數據分析。
[0028] 2、實驗結果 2. 1龍眼蛋白多糖對東莨菪堿所致學習記憶障礙小鼠避暗行為實驗潛伏期的影響： 表1龍眼粗多糖對東莨菪堿所致學習記憶障礙小鼠避暗行為實驗潛伏期的影響
注：每一列中字母不同代表差異顯著（/<0.05)。
[0029] 明暗箱是利用小鼠好暗避光，對厭惡刺激(如足電擊）的恐懼來檢測其大腦記憶功 能。
[0030] 小鼠在服用龍眼蛋白多糖21天后采用明暗箱進行學習記憶功能的測試。從表1 可以看出，在記憶的獲取階段（〇h)，5組小鼠都快速的進入暗箱，其潛伏期沒有顯著差異， 這表明5組小鼠的生活習性正常。在學習記憶的保持階段（24h)，與對照組相比，注射東莨 菪堿的模型組小鼠進入暗箱的時間快，潛伏期短，表明模型組小鼠已有記憶功能障礙；與 模型組小鼠相比，服用了龍眼蛋白多糖的3組小鼠的潛伏期顯著增加了（p〈0. 05