黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及黃芩的新用途。
【背景技術】
[0002] 肝硬化腹水是肝硬化進入失代償期的重要標志之一，是肝硬化主要合并癥中最常 見癥狀。一旦出現腹水，2年內的死亡率達到50%，需要考慮肝移植。85%的腹水由肝硬化 引起，其余病因包括惡性腫瘤（10%)、心功能不全（3%)、結核（2%)、胰腺炎（1%)等。國 際腹水協會（International ascites club)將腹水分為無并發癥的腹水（uncomplicated ascites)和難治性腹水（refractory ascites)。其中難治性腹水包括利尿劑耐藥型腹水 (飲食限鈉90mmol/d，相當于5. 2g鹽以下和強化利尿治療安體舒通400mg/d和速尿160mg/ d至少一周無效）和利尿劑難治型腹水（由于利尿劑導致的并發癥限制了利尿劑有效劑量 的應用，從而使腹水難以控制）。利尿劑可以導致肝性腦病、腎功能損害、低鈉血癥、低鉀或 高鉀血癥等并發癥。現代臨床上腹水治療方法包括臥床休息、限鈉、限水、使用利尿劑、治療 性腹穿和經頸靜脈肝內門體分流（TIPS)等幾種方式。但均有一定的禁忌癥和副作用，例如 醛固酮受體拮抗劑（螺內酯）有抗雄激素的作用和高鉀血癥副作用，呋塞米常會引起嚴重 電解質紊亂和代謝性堿中毒，過量的利尿劑會造成血管內容量不足（25%)導致腎功能損 害、肝性腦病（26% )和低鈉血癥（28% )且存在利尿劑無效和耐藥情況；治療性腹腔穿刺 后影響循環功能，其功能不全的嚴重性與生存率有關；經頸靜脈肝內門體分流（TIPS)可引 起肝性腦病的發生率約25% (在60歲以上較多見），Child-Pugh C患者行TIPS后預后不 良，且增加心臟的前負荷，對有心臟病者可誘發心衰。以上的治療方法均達不到理想的治療 效果，因此，尋找和開發副作用小、治療效果穩定的治療肝硬化腹水的方法成為當前急需解 決的問題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供黃芩的新用途。具體為黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物 中的應用，黃芩在制備治療肝功損傷的藥物中的應用，黃芩在制備治療肝纖維化的藥物中 的應用，黃芩在制備治療肝臟組織損傷的藥物中的應用，黃芩在制備治療低蛋白血癥的藥 物中的應用，黃芩在制備治療膽汁淤積的藥物中的應用。
[0004] 黃芩的給藥方式及給藥劑量為：
[0005] 水煎液制備方法：
[0006] 黃芩600g，第一次加10倍水煎煮lh，第二次加8倍量水煎煮lh，合并煎液，濃縮干 燥，研成細粉備用。給藥劑量為黃芩高劑量組（12g生藥/Kg)、低劑量組（3g生藥/Kg)。
[0007] 本發明通過觀察給予黃芩后大鼠癥狀與體征（腹圍，24h尿量）的變化，并通過相 關的藥效學評價，包括肝功（ALT、AST)、血清總膽紅素（TBIL)、腎功（Cr，BUN)、血清肝纖維 化（HA、LN、PC III和C IV)及肝組織病理學觀察，評價肝硬化腹水模型時肝腎功能損傷，明確 黃芩對肝腹水及肝損傷的改善作用。
[0008] 分析黃芩對肝腹水模型大鼠的血清離子（Na+、K+、Cl )、血漿膠體滲透壓及血清蛋 白（COP、ALB、TP)、血漿腎素-血管緊張素系統（RAS)Ang II和SRA、抗利尿激素（AVP)、內 皮素I(ET-I)的改善作用；利用Western blot及RT-PCR等分子生物學手段，研究黃芩對肝 腹水模型大鼠腎組織水通道蛋白2 (AQP2)、AVP受體（V2R)的蛋白及基因表達情況，觀察黃 芩對腎水通道蛋白及AVP受體表達的影響，同時，對膽總管中水通道蛋白4(AQP 4)蛋白及基 因表達進行測定，探討黃芩對膽汁排泄的影響。
[0009] 本發明包含以下有益效果：
[0010] 本發明在總結大量文獻報道及臨床治療經驗的基礎上，提出黃芩具有逐水功效。 根據肝硬化腹水疾病的特點、發病機制及疏肝利水活血的治療法則，提出黃芩可以適用于 治療肝硬化腹水。
[0011] 本發明發現黃芩可以有效的干預甚至治療肝腹水模型的癥狀，機制可能是：1改 善肝腎功能；2改善低蛋白血癥（ALB、TP)和升高膠體滲透壓（COP) ;3上調膽管AQP4促進膽 管分泌排泄膽汁；4調節電解質紊亂，調節血管通透性，5抑制RASS，下調血漿ET-1、Ang II 和血清SRA濃度，抑制AVP、V2R、AQP2,減輕水鈉潴留，促進尿液排泄。與現代治療方法比 較，具有避免了肝性腦病、腎功能損害、低鈉血癥、低鉀或高鉀血癥等電解質紊亂等并發癥， 且治療費用低廉，使用方法簡單，治療效果理想等優點，利于臨床實踐應用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為正常組大鼠肝臟HE染色照片；
[0013] 圖2為CC14模型組大鼠肝臟HE染色照片；
[0014] 圖3為黃芩低劑量組大鼠肝臟HE染色照片；.
[0015] 圖4為黃芩高劑量組大鼠肝臟HE染色照片；
[0016] 圖5為黃芩給藥前后對肝腹水模型大鼠血清TP的影響；
[0017] 圖6為Western Blotting法測定V2R、AQP2及AQP4蛋白的實驗結果；
[0018] 圖7為圖6中腎組織V2R蛋白相對表達水平；
[0019] 圖8為圖6中腎組織AQP2蛋白相對表達水平；
[0020] 圖9為圖6中膽總管AQP4蛋白相對表達水平；
[0021] 圖10為熒光定量PCR測定V2R-mRNA的相對表達量；
[0022] 圖11為熒光定量PCR測定AQP2-mRNA的相對表達量；
[0023] 圖12為熒光定量PCR測定AQP4-mRNA的相對表達量。
【具體實施方式】
[0024] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0025] 一：本實施方式黃芩在制備治療肝硬化腹水的藥物中的應用。
[0026] 本發明保存了黃芩的逐水功效，發現其在肝腹水上的適用性及作用機制，擴展了 中藥治療肝腹水的使用范圍，具有見效快、療效好、療效高、副作用小等特點。
[0027]
【具體實施方式】二：本實施方式與【具體實施方式】一不同的是：黃芩的給藥方式具體 為：黃芩600g，第一次加10倍水煎煮lh，第二次加8倍量水煎煮lh，合并煎液，濃縮干燥， 研成細粉。其它與【具體實施方式】一相同。
【具體實施方式】 [0028] 三：本實施方式與一不同的是：黃芩的給藥劑量為 3~12g生藥/Kg。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0029] 四：本實施方式黃芩在制備治療肝功損傷的藥物中的應用。
【具體實施方式】 [0030] 五：本實施方式黃芩在制備治療肝纖維化的藥物中的應用。
【具體實施方式】 [0031] 六：本實施方式黃芩在制備治療肝臟組織損傷的藥物中的應用。
【具體實施方式】 [0032] 七：本實施方式黃芩在制備治療低蛋白血癥的藥物中的應用。
【具體實施方式】 [0033] 八：本實施方式黃芩在制備治療膽汁淤積的藥物中的應用。
[0034] 通過以下試驗驗證黃芩治療肝硬化腹水的效果：
[0035] 水煎液制備方法及給藥劑量為：黃芩600g，第一次加10倍水煎煮lh，第二次加8 倍量水煎煮Ih，合并煎液，濃縮干燥，研成細粉備用。
[0036] 肝硬化腹水模型的制備及篩選：將100只雄性SD大鼠于SPF環境中飼養。隨機 分為兩組：對照組10只，腹腔注射等體積橄欖油溶液，普通飲水；模型組90只，前兩周給予 0. 3g/L苯巴比妥飲水，第3周開始飲用10%的醫用酒精，腹腔注射40% CC14-橄欖油混合 液（2ml/kg)，2次/周，持續造模12周。篩選標準為：腹水穿刺陽性；血清白蛋白（ALB) < 34. lg/L;血漿膠體滲透壓（COP) < 17. 4mmHg，三者均陽性結果的大鼠納入實驗組。造模成 功后的大鼠放進代謝籠并進行藥物干預一周后采樣。分組及給藥如下：空白對照組：正常 飼養，未進行任何處理；肝腹水模型組：相同體積生理鹽水；黃芩低劑量組：3g生藥/Kg ;黃 芩高劑量組：12g生藥/Kg ;各組動物給藥體積均為lml/100g。
[0037] 本試驗在總結大量文獻報道及臨床治療經驗的基礎上，提出黃芩能治療肝硬化腹 水。根據中西醫辯證，利用苯巴比妥、乙醇聯合四氯化碳（CCL 4)制備的大鼠肝腹水模型符 合肝硬化腹水的發病機制，故采用此模型進行黃芩干預作用及作用機制的評價。根據肝硬 化腹水的癥型采用黃芩的保肝利膽，逐水實現疏肝利水活血的治療法則，來達到治療肝硬 化腹水的目的。
[0038] 步驟一：樣品的采集及處理方法
[0039] (一）尿液的采集：收集末次給藥24h的尿液，4°C，8000r ?min1離心IOmin取上 清液，至-80 °C保存備用。
[0040] (二）血清及血漿的采集與處理：尿液接取完畢后，用20%烏來糖麻醉，自眼底靜 脈叢采集血液3ml，室溫靜置30分鐘后，4°C，4000r ? min 1離心10min取上清液，于-80°C 低溫保存。血漿采集時用肝素鈉抗凝、處理方法同血清處理。
[0041](三）腎臟、膽總管及肝臟的采集：取血完畢后，迅速開腹摘取腎臟組織，分離并獲 取膽總管，放入預先處理好的Ep管中，液氮速凍，-80°C冰箱保存液氮內留存備檢，用于后 續Western Blotting及RT-PCR的相關測定；另剪取部分肝臟組織，放入4°C，4%多聚甲醛 溶液內，置搖床上輕輕振蕩24h，使組織充分固定，用于HE染色。
[0042] 步驟二：血清及血漿指標的檢測
[0043] (一）血清肝腎功能檢測：血清肝功能指標ALT、AST、T-BIL ;腎功能指標BUN、Cr ; 由黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心代測。
[0044] (二）血漿膠體滲透壓、血清總蛋白、白蛋白的測定：由黑龍江中醫藥大學附屬第 一醫院檢驗中心代測。
[0045] (三）血清K+、Na+、Cl-濃度測定：由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院檢驗中心 代測。