Sculponin R在制備治療腎癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化合物Sculponin R的新用途，具體涉及Sculponin R在制備治療腎 癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] Hua-Yi Jiang等人首次分離純化出化合物Sculponin R，并將成果發表在著名 天然產物雜志 Journal ofNatural Product 上（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J. Nat. Prod.，2013, 76, 2113-2119) 〇
[0003] 目前尚未有該化合物關于治療腎癌的活性報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種Sculponin R的醫藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術方案實現的：
[0006] Sculponin R在制備治療腎癌藥物中的應用，所述Sculponin R化學結構式如下，
[0008] 進一步地，所述腎癌為腎癌786-0和0S-RC -2。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容。
[0010] 實施例1 :Sculponin R的分離制備及結構確證
[0011] Sculponin R的制備方法同文獻報道的制備方法（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J.Nat.Prod.，2013,76， 2113-2119)。
[0012] 結構確證：白色無定形粉末，分子式為CmH26O7，不飽和度為8。核磁共振氫譜 數據 S H (ppm，DMS0-d6,400MHz) :H-1 (5. 32, t，J = 8. 4)，H-2 (2. 44, m)，H-2 (2. 12, m)， H-3 (3. 79, d，J = 4. 4)，H-5 (3. 99, d，J = 3. 3)，H-6 (5. 88, d，J = 3. 3)，H-9 (2. 22, d，J = 10.6)，H-Il (4.43, m)，H-12 (2. 62, overlap)，H-12 (1.65, m)，H-13 (2.49, m)，H-14 (2. 84， m)，H-14(2. 61，overlap)，H-17(l. 50, s)，H-18(l. 26, s)，H-19(l. 04, s)，H-20(4. 73, d，J =9. 2)，H-20(4. 19, d，J = 9. 2);核磁共振碳譜數據 S c(ppm，DMS0-d6,100Hz) :71. 5(CH， 1-C)，34. 7 (CH2, 2-C)，81. 6 (CH，3-C)，42. I (C，4-C)，52. 8 (CH，5-C)，109. I (CH，6-C)， 171. 2(C，7-C)，56. 3(C，8-C)，54. 0(CH，9-C)，51. 3(C，10-C)，64. I (CH，11-C)，33. 9(CH2， 12-C)，41. 4 (CH，13-C)，31. I (CH2,14-C)，211. 8 (C，15-C)，78. 0 (C，16-C)，19. I (CH3,17-C)， 20. 9 (CH3,18-C)，28. 2 (CH3,19-C)，76. 2 (CH2, 20-C)。結構確證數據與文獻報道一致，因此可 以確定本發明制備的化合物即為文獻報道的Sculponin R。
[0013] 實施例2 :Sculponin R的藥理作用試驗
[0014] -、材料和儀器
[0015] 786-0腎癌細胞株、0S-RC-2腎癌細胞株均購自中科院細胞庫。Sculponin R自 制，HPLC歸一化純度大于98%。RPMI-1640培養基、lOOU/mL青霉素及100 y g/mL鏈霉素、 IXPBS緩沖液、胰酶-EDTA購于美國HyClone。胎牛血清購于美國Gibco。細胞增殖與毒性 檢測試劑盒（中國）。基質膠購于美國BDBioscience。
[0016] HERAcell240i恒溫孵箱、GmbHD-37520低溫離心機、1510酶標儀為芬蘭Thermo公 司產品。頂T-2倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產品。DFC480正置顯微鏡為德國徠卡 公司產品。MDF-U53V-80°C超低溫冰箱為日本SANYO公司產品。YDS-50B-80液氮儲存罐購 自中國成都液氮容器廠。BC-185GE 4°C冰箱為中國益友公司產品。Minispinplus小離心機 為Eppendorf公司產品。powerpac300電泳儀為美國Biorad公司產品。Las4000mini凝膠 成像儀為日本FUJIFILM公司。
[0017] 二、試驗方法
[0018] 1、細胞培養
[0019] (1)常規培養及細胞傳代：786-0及0S-RC-2腎癌細胞株均培養在改良型 RPMI-1640培養基中，常規培養時加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素，構成完全培 養基。培養條件為37°C、5% CO2的恒溫培養箱。正常情況下786-0及0S-RC-2細胞均為貼 壁生長。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，一般隔天換液一次。換液時先吸去 培養瓶或培養皿中培養基，加PBS洗漆2次后再加入完全培養基。細胞密度達到80-90 %且 細胞形態仍保持良好時進行傳代，傳代周期一般為3天。細胞傳代步驟如下：1)先棄去培養 瓶內培養基，PBS洗2次；2)培養瓶內加ImL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育約3分鐘，倒置顯微 鏡下觀察細胞變圓并脫落后，加入3mL完全培養基終止消化，并用吸管將成團的細胞吹散； 3)細胞懸液移至15mL離心管中，1000轉/分離心5分鐘，棄去上清，加入完全培養基吹散 細胞沉淀，分裝到3個培養瓶中，置于37°C、5% CO2中繼續培養。
[0020] (2)細胞凍存：細胞處于對數生長期，狀態良好并且細胞密度達到80~90 %凍存 細胞，步驟如下：1)配制細胞凍存液：將改良型RPMI-1640培養基、胎牛血清、DMSO按7:2:1 比例混合、震蕩混勻；2)消化、離心細胞（具體見細胞傳代步驟）；3)離心后吸去上清液，加 入凍存液并吹勻，調整細胞計數約I X 107mL，移至I. 2mL凍存管中。在凍存管標記凍存日期 及細胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分鐘，移至-20 °C冰箱2小時，再移至-80 °C 冰箱過夜，次日轉入液氮中保存。
[0021] (3)細胞復蘇：1)水浴鍋預熱到37°C準備；2)從-80°C冰箱或液氮中取出細胞，迅 速放入37°C的水浴鍋中并搖動，使其內液體在1-2分鐘內融化；3)將融化后的細胞懸液移 置15mL離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，離心后棄去上清并加入完全培養基。4)將細 胞置于37°C、5% CO2培養箱中培養，次日觀察細胞狀態并換液。
[0022] (4)細胞計數：1)細胞消化，吹散制備細胞懸液，方法同細胞傳代。用加樣器吸取 20 y L懸液沿蓋玻片邊緣燒靠外側滴加，使懸液由于氣壓影響均勻吸入計數察，健康活細胞 呈規則圓形、透明狀。計算計數板4個角的4大格內細胞數（格子邊線上的細胞只記上邊、 不計下邊；只記左邊、不記右邊）。細胞密度=4大格細胞總數X0. 25X 107mL。
[0023] 2、細胞增殖曲線繪制
[0024] (1)當786-0及0S-RC-2細胞處于對數生長期，密度80~90%時，制備細胞懸液 并細胞計數，方法同上。調節細胞懸液濃度為IXIO5AiL; (2)接種細胞懸液ImL接種于于 24孔板上，然后再根據不同條件加藥，保證每孔細胞數基本一致。同一種細胞同一種加藥 條件設計計數6天，每天計數3個孔，即每種條件需設置18個孔；（3)將培養板置于37°C、 5% 0)2中培養；(4)從接種次日開始計數，記為第1天（第0天細胞數記為接種細胞數，即 IXIO5)。每孔加200yL胰酶-EDTA，消化、吹散、計數即可。每隔24小時取3個孔進行細 胞計數；（5)根據計數所得數據繪制細胞生長曲線。
[0025] 3、WST-8細胞活力實驗
[0026] (1)收集對數生長期的786-0及0S-RC-2細胞，制備細胞懸液、細胞計數，方法同 上。調節細胞懸液濃度為4X IO4mL; (2)每孔中加入50 y L細胞懸液（即2000個細胞/ 孔），然后各逾加入含有設計值2倍濃度藥物的完全培養基50 y L混勾，這樣使藥物終濃度 恰好為設計值，且保證了各孔細胞數的一致性。每個條件設置5個復孔；（3)將細胞置于 5% C02、37°C條件下的細胞培養箱中孵育；(4)分別在24小時和48小時后終止培養，吸取 孔內培養基，更換新鮮完全培養基，每孔加入10 y LWST-8溶液，用加了新鮮完全培養基和 WST-I溶液但沒有接種細胞的孔作為空白對照；（5)避光條件下置于搖床5分鐘搖勾，后繼 續放入37°C、5% CO2條件下培養箱中培養1小時；(6)酶標儀下測定450nm吸光度值；(7)