共軛亞油酸促進骨折愈合的新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及共輒亞油酸促進骨折愈合的新用途，屬于醫藥新用途技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著全球經濟的不斷發展、人類交際及流動范圍的迅速擴大、延伸與頻繁，拌之交 通手段的快速發展，則創傷造成的骨折發生率逐年增高，因此有關骨折的修復一直是骨科 學界研究的熱點問題。骨折愈合受全身和外界因素等多因素的影響，目前相關研究多關注 骨折內固定材料和手術方式，以及藥物應用等方面對骨折愈合的影響，很少注意到營養物 質代謝同樣也是一個重要影響因素。
[0003] 最近研究報道共輒亞油酸可以直接促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，促經 骨形成。成骨細胞和破骨細胞的動態平衡在骨折愈合過程中具有重要的作用，那么共輒亞 油酸是否對骨折愈合有促進的作用。
[0004] 共輒亞油酸（(conjugated linoleic acid?簡寫CLA))是一組含有共輒雙鍵的亞 油酸的同分異構體混合物，以雙鍵在9和11 (c9, tll-CLA)或10和12(tl0, C12-CLA)位置 上的同分異構體含量最多，屬于多不飽和脂肪酸。已發現CLA的天然形式主要存在于反芻 動物的肉類和奶制品。近年來的廣泛研究證明，共輒亞油酸有多種生物學活性，例如減少動 脈粥樣硬化的嚴重程度，改善免疫不良刺激的影響，改善瘦素抵抗來發揮其降脂，CLA可以 抑制腫瘤細胞繁殖、抑制腫瘤細胞向細胞外基質成分和纖維粘連蛋白粘附的作用。且具既 無毒又無任何副作用的生物安全性。目前國內、外沒有關于CLA對骨折愈合方面的相關研 究，故設計本實驗研究CLA對骨折愈合的影響，以期提高我們對營養物質代謝在骨折愈合 中重要作用的認識，為我們今后對骨折愈合的治療提供又一有效的方法和途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了共輒亞油酸的系列生物學實驗，為開拓共輒亞油酸促進骨折愈合的 新用途提供了依據。具體生物學實驗研究結論包括以下方面：
[0006] 通過建立骨折模型，從血樣、影像學檢查、力學測試、組織學檢查等方面研究共輒 亞油酸對模型動物的影響。血清堿性磷酸酶（ALP)活性在骨折后2周時兩組對比有顯著性 差異（P〈0. 01)，X線攝片評價顯示共輒亞油酸干預組4周骨折線模糊，骨折端骨痂體積大、 骨痂數量多，三名骨折醫生對骨折后6周進行評分較空白對照組具有明顯統計學差異。根 據實驗結果推測：①共輒亞油酸可以促進骨折愈合。②增強機體內成骨活動，提高ALP的活 性。提示其具有開發性的骨折藥物的前景。
【附圖說明】
[0007] 圖I :CLA組與空白兩組在不同時間點對大鼠血清ALP濃度的測定對比結果，在2 周時CLA干預組ALP濃度均明顯高于生理鹽水對照組（p = 0. 0126);
[0008] 圖2為CLA組與空白干預兩組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具有代表性的X 光片對比；
[0009] 圖3為影像學對骨折愈合組織的分級評分結果示；
[0010] 圖4為CLA組與空白組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具代表性的Micro-CT 掃描圖像對比（骨折愈合第4、6周）；
[0011] 圖5為CLA組與空白組在不同時間點的大鼠脛骨骨折斷端ROI的BMD測定比較；
[0012] 圖6為CLA組與空白組在不同時間點的大鼠脛骨骨折斷端橫截面積（CSA)測定比 較；
[0013] 圖7為CLA組與空白組在不同時間點的骨強度指數（BSI)的計算結果比較；
[0014] 圖8為CLA組與空白組在骨折愈合第6周最大彎曲應力測試比較；
[0015] 圖9 CLA組與空白組為在骨折愈合第6周大鼠骨折骨痂HE染色比較。
【具體實施方式】
[0016] 以下所列實施例，僅為幫助本領域技術人員更全面理解本發明，但不以任何方式 限制本發明。
[0017]〈實施例1>共輒亞油酸對小鼠骨折模型的影響
[0018] 1動物及主要材料
[0019] 1.1實驗動物
[0020] 雌性Sprague-Dawley大鼠30只，清潔級，體質量（200 ±15) g
[0021] 1.2試劑和儀器
[0022] 共輒亞油酸（順-9,反-11CLA，37. 6%;反-10,順-12CLA，39. 3% ;C18:1，10. 11 %; cl8:0,2. 04%，青島澳海生物有限公司）
[0023]2實驗方法
[0024] 2. 1動物分組
[0025] 將30只雌性SD大鼠骨折造模后隨機分成2組，每組15只，A空白對照組 (Control):給予生理鹽水灌胃，B給予共輒亞油酸（CLA)灌胃干預（10g/Kg Miet)，曾有報 道應用該劑量研究共輒亞油酸對去勢大鼠鈣代謝和骨代謝的影響，實驗過程中對動物的處 置方法符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
[0026] 2. 2骨折大鼠骨折模型的建立與給藥方法
[0027] 用10%水合氯醛以3mL/kg進行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥，四肢固定于手術臺 上，各組大鼠行左側脛骨中段縱形皮膚切口，長約2cm，沿脛前肌肌間隙鈍性分離達脛骨干， 固定脛骨，在脛骨干中段用線鋸鋸斷成橫行骨折，此過程注意保護神經和肌肉組織，再以直 徑為0. 8_的克氏針逆行穿入骨折近端且從脛骨結節穿出，復位骨折后再將其順行穿入骨 折遠段髓腔，生理鹽水沖洗，逐層關閉傷口。不包扎，不固定。術后在大鼠尾部標記，待麻醉 醒后放入籠中喂養，自由取食、飲水。
[0028]按照SD大鼠生活習性，活動多集中在黃昏到清晨這段時間，白天常在閉目休息， 所以選擇每日的灌胃時間在晚上6-8點之間。并自動物骨折模型造模成功后第一天開始進 行灌胃干預。每天18 :00灌胃一次，灌胃劑量為：A組給予生理鹽水灌胃，B組給予共輒亞 油酸灌胃干預（l〇g/Kg ? diet)，其他食物統一給標準鼠糧。各組大鼠均自由進食飲水，12h 光照周期。
[0029] 3標本的采集與檢測
[0030] 3. 1血樣采集與檢測
[0031] 血清堿性磷酸酶（ALP)測定：骨折造模后第2周、第4周和第6周，處死5只實驗 大鼠取I. 5ml血，離心后取上清液測定。
[0032] 3. 2影像學檢查
[0033] 3. 2. I X-Ray 攝片
[0034] X射線檢查大鼠脛骨骨痂的連續性及骨折愈合情況：在脛骨骨折造模后第2周、第 4周和第6周將各組大鼠用10%水合氯醛以3mL/kg進行腹腔注射麻醉后計算機X射線攝 相儀（DR)攝片，拍攝條件為50kV，2. 5ms，觀察大鼠脛骨骨痂的連續性及骨折愈合情況。
[0035] 評價方法采用骨痂形成的影像學評分：每張片均由3名高年資的骨科醫生分別 評分，對骨折斷端愈合組織具體評分標準：〇-無骨痂形成；1-少量或者中等量骨痂形成； 2_有豐富的骨痂形成；3-有連接骨膜骨痂形成，似"橋型連接";4-成熟的連接骨痂；5-連 接骨痂吸收完成，骨折完全連接。如表1所示：
[0036]
[0037] 3. 2. 2Micro_CT 掃描
[0038] 對大鼠脛骨骨折愈合第4周和第6周，進行MicroCT掃描，設定電壓65KV，電流 385mA，層間距17. 51 ym，以脛骨骨折線為中心，沿脛骨縱軸上下圍繞骨痂周圍各取200個 掃描層面，共400個層面，建立三維興趣區（ROI)以250ms的積分時間帶有0. 7°旋轉對興 趣區進行掃描。對骨痂形態學參數分別測量和計算分析，測量以骨折斷端為中心ROI的平 均橫截面積（CSA，cm 2)和ROI骨密度（BMD)。觀察及計算兩組以骨折端為中心ROI骨段的 力學強度指數（BSI)。骨強度指數可以客觀的反應出骨折愈合情況，并能夠提供具體的量 值，具有很強的準確性和特異性。
[0039] 骨強度指數（BSI)=橫截面積X骨密度，SP (BSI = CSAXBMD)
[0040] 3. 3力學測試
[0041] 在大鼠骨折愈合第6周通過"三點力學"測試評估骨折愈合強度，通過骨折愈合強 度能夠有效的評估和說明骨折愈合程度。將大鼠無痛處死后注意保護骨折斷端愈合的骨 痂組織，將其周圍的軟組織完全剝離。將脛骨放置在生物力學測試儀上，以17mm為跨度，以 5mm/min的速度下降加載負荷載力，直至脛骨斷裂[13]，根據載荷-變形曲線得出骨折端最 彎曲載荷力作為計量生物力學指標。
[0042] 3. 4組織學檢查
[0043] 3. 4. 1組織學標本的制備：
[0044] 無痛處死大鼠，將大鼠左后側脛骨分離，并注意保護骨折斷端愈合的骨痂組織，將 其周圍的軟組織完全剝離。標本于10%的福爾馬林中浸泡固定120h，自來水沖洗24h，按 組織學檢查的要求以及術前造模，以相應骨折部位為標志，在向脛骨遠端和近端延長0. 5CM 處（以確保能完整獲取骨折愈合區域）用于脫鈣組織學染色。
[0045] 4?統計學分析：
[0046] 采用SPSS17. 0對數據進行分析，采用均數土標準差表示，若數據服從正態性及 方差齊性米用兩個獨立樣本的t檢驗，否則米用Wilcoxon秩和檢驗，檢驗水準a = 〇. 05， P〈0. 05為差異有統計學意義。
[0047] 5實驗結果
[0048] 5. 1血生化指標檢測結果：堿性磷酸酶（ALP)測定
[0049] 骨折2、4、6周后CLA干預組和空白對照組ALP濃度均有不同程度的升高，CLA干 預組在2周時ALP濃度均明顯高于生理鹽水對照組（p = 0. 0126);骨折后4周、6周CLA干 預組血清ALP濃度均高于生理鹽水A組，無統計學意義，如圖1所示。
[0050] 圖1:空白與CLA兩組在不同時間點的大鼠血清ALP濃度測定對比結果，在第2周、 4周、6周ALP的結果均比Control組高，其中在2周時CLA組ALP濃度均明顯高于Control 組（p = 0? 0126)*P < 0? 05。
[0051] 5. 2影像學檢查結果：X線檢查結果
[0052] X-Ray攝片：通過對CLA組和Control組X-Ray攝片的觀察和分析，在骨折愈合 第2周，未發現兩組有明顯區別，骨折斷端變化不明顯，骨折線清晰可見，未見骨痂組織形 成。在骨折愈合第4周，發現兩組均有骨痂形成，骨折線模糊，CLA組均有大量骨痂形成， 而Control組部分有骨痂形成，部分骨折線模糊，但未見明顯骨痂。在骨折愈合第6周，是 發現CLA組骨折斷端愈合，骨折線消失，多數外骨痂近于消失接近健康骨骼結構和外形， Control組均產生大量骨痂，骨折線消失，但無一例接近骨折完全愈合標準，見圖2, CLA組 與Control組大鼠脛骨骨折斷端在不同時間點最具代表性的X-Ray攝片對比；
[0053] 從圖2結果可以看出：可以看出骨折愈合第2周兩組變化不明顯，第4周骨折斷 端均可見骨痂形成，第6周發現CLA組愈合接近完全愈合，Control組仍有外骨痂，并沒有 達到完全愈合標準。
[0054] X-Ray 攝片評分：通過 3 名骨科醫生依照 "Radiographic Grading Scale of Fracture Callus Formation"的標準評分分析，在骨折愈合第2周CLA組：I. 08±0. 16 分；Control 組：0? 83