000、2000 和 5000 的單 甲氧基PEG、曙紅Y、DMAP、巧S酬、油酷氯、芝麻油和其它未指定的試劑純化合物來自密蘇 里SaintLouis的Sigma-Al化ich。1-棟桐酷基-2-油酷基-sn-甘油-3-憐酸乙醇胺和 大豆憐脂酷膽堿（95% )購自北卡羅萊納Morrisville的AvantiPolarLipids。JP4-039 由AsymchemInc.通過已知的程序合成。
[0124] 1化).作為JP4-039結晶的增溶劑和抑制劑的保護的氨基酸衍生物的篩選。通過 分別在5分鐘期間內添加溶于SmLTHF中的過量4倍的乙酸酢或氯甲酸異下醋由溶于5mL飽和碳酸氨鋼溶液中的a-NH2-e-Boc-賴氨酸（Immole)合成a-乙酷基-e-Boc-賴氨 酸、a-異下氧基氨甲酯基-e-Boc-賴氨酸。從反應混合物中去除THF，將剩余混合物用 50mL乙酸乙醋稀釋。有機相用20mL飽和胞肥〇3、鹽水、巧樣酸（0. 5M)和水順序洗涂。將 有機相用無水硫酸鋼干燥，并且去除溶劑。將固體殘留物從乙酸乙醋/己燒混合物中重結 晶。運些衍生物與一組可商購的賴氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸的胺保護的衍生物一起制備成 I-IOOmM的溶液或在0.IM成冊〇4緩沖液中的懸浮液。同時，將溶于5yL甲醇中的0. 447yg JP4-039添加至96孔聚苯乙締板的每一個孔中。將一百iiL氨基酸溶液/懸浮液添加至甲 醇溶液中并混勻。視覺檢查每個孔中樣品的物理狀態，在2小時內定期出現棟色結晶外觀。 20分鐘后在顯微鏡下給一些樣品拍照。
[012引 1(c).陽G-氨基酸或膚脂綴合物的合成。單甲氧基陽G2,w0-a-Fmoc-e-油 酷基賴氨酸（1):將單甲氧基陽62,。。。地（1臟01)與0斗1110(3-￡-1：-80(3賴氨酸（2臟01)、DCC(2. 2mmol)和DMAP(0.Immol)在CH2CI2中室溫下醋化過夜。通過過濾去除固體沉 淀。通過蒸發濃縮濾液。PEG衍生物用10倍體積冷乙酸沉淀，并用相同溶劑洗涂S 次。再用冷乙醇洗涂W去除DMAP。將陽G-a-Fmoc-e-t-Boc賴氨酸醋溶于4mLCH2CI2 中，向其中添加4mLTFA，W在室溫下去保護Boc基20分鐘。去除大部分CH2CI2后， 用冷酸沉淀PEG-a-Fmoc-e-畑廠賴氨酸醋并用相同溶劑再洗涂兩次。用油酷氯 (2mmol)和TEA(2mmol)圭寸端PEG-曰一Fmoc-e-NHz-賴氨酸酯20分鐘。用ii沉淀法純化 陽G-a-Fmoc-e-油酷基賴氨酸醋（1)S次，并用乙醇沉淀兩次。W陽Gz,。。。計收率為87 %。 'HNMR(400MHz) 5 7. 69-7. 19 (m, 8H),5. 23-5. 22 (m, 2H),5. 08 (s, 2H),4. 98-4. 95 (m, 2H),4. 1 2-4.10(111，1巧，3.56-3.52任66峰），3.26(3,3巧，3.21-3.17(111，2巧，2.09-1.88(111，6巧，1.27 -1. 16(m，28H)，0. 77(t，3H)。
[0126] 單甲氧基陽Gi,nnn-a-Fmoc-賴氨酷基-a-Fmoc-e-(二油酷基賴氨酷基）賴氨 酸似：將陽G-a-Fmoc-e-NH廠賴氨酸醋（Immol)與 4mmo1TEA,a-Fmoc-e-t-Boc賴氨 酸（I. 5mmol)、DCC(I. 7mmol)和畑S(LSmmol)在CHzClz=THFa:1)中在(TC下反應 20 分 鐘，然后在室溫下反應過夜。通過用巧=酬測試的陰性結果來確定反應完成。用冷酸和乙 醇沉淀法純化單甲氧基陽Gi,。。。a-Fmoc-賴氨酷基-a-Fmoc-e-t-Boc-賴氨酸醋，TFA去 保護，然后酸沉淀和洗涂得到陽Gi,。。。-a-Fmoc-賴氨酷基-a-Fmoc-e-畑2-賴氨酸醋。該 e-畑2-端陽Gi,。。。-賴氨酸衍生物用4mmolTEA、用DCC(1. 7mmol)和畑S(l.Smmol)預活化 的N，N'-二油酷基賴氨酸（I. 5mmol)封端過夜。生成的2用類似于酸和醇沉淀法純化。W 甲氧基陽Gi,。。。計 2 的收率大約為 75%。古NMR5 7. 70-7. 20 (m, 24H)，5. 35-5. 34 (m, 2H)，5. 14-5. 09 (m, 6H)，4. 27-4. 22 (m, 2H)，3. 70-3. 61(PEG峰），3. 39(S,3H)，3. 21-3. 07 (m, 6H)，2. 0 1-1. 97 (m, 6H)，1. 49-1. 23 (m, 40H)，0. 89 (t, 3H)。
[0127] 單甲氧基陽G2,。。廣賴氨酷基-(a-Fmoc-e-油酷基賴氨酸）2(3):將甲氧基 陽G2,〇〇〇-〇H(lmmol)與二-t-Boc賴氨酸（2mmol)、DCC(2. 2mmol)和DMAP(0.Immol)在CH2CI2 中醋化過夜，然后用類似酸和乙醇沉淀步驟生成單甲氧基PEG-二-Boc-賴氨酸醋。TFA去保 護和酸沉淀并洗涂后，將陽G-賴氨酸醋與4mmo口EA、a-Fmoc-e-t-Boc-賴氨酸（3mmol)、 DCC(3. 5mmol)和NHS(3mmol)在CH2Cl2:THF(l:l)中在(TC下綴合20分鐘，然后在室溫綴合 過夜。通過根據巧=酬測試的陰性確定反應的完成。通過冷酸和乙醇沉淀法純化單甲氧基 PEG-賴氨酷基-(a-Fmoc-e-t-Boc-賴氨酸）2,TFA去保護，然后通過酸沉淀和洗涂W得到 陽G-賴氨酷基-(a-Fmoc-e-畑2-賴氨酸）2。該e-畑2-賴氨酷基端陽G衍生物用4mmol TEA和4mmol油酷氯封端20分鐘。在常規的酸和乙醇沉淀和洗涂之后，W72 %的收率獲得 純化的 3。電NMR5 7. 36-7. ：34 (m, 16H)，5. 35-5. 30 (m, 4H)，5. 14-5. 09 (m, 4H)，4. 27-4. 22(m ，6H)，3. 70-3. 61(PEG峰），3. 41(S,3H)，3. 21-3. 07 (m, 6H)，2. 01-1. 97 (m, 6H)，1. 49-1. 23 (m, 62H)，0. 89 (t, 6H)。
[0128] 單甲氧基陽Gg,。。廠賴氨酷基-[賴氨酷基-(a-Fmoc-e-油酷氯賴氨酸）2]2(4): 將衍生自甲氧基陽Gs,。。。的陽G-賴氨酸醋（Immol)與二-t-Boc賴氨酸（3mmol)、 DCC(3. 5mmol)和NHS(3mmol)在CHzCkTHFl:!中在(TC下綴合20分鐘，然后在室溫綴合 過夜。通過巧=酬測試確定反應完成。通過冷酸和乙醇沉淀法純化單甲氧基PEGs,。。。-賴 氨酷基-(二-t-Boc-賴氨酸）2。TFA去保護，然后通過酸沉淀和洗涂生成陽G-賴氨酷 基-(a-畑2-e-畑2-賴氨酸）2。將該四e-畑2端陽G-賴氨酸衍生物與a-Fmoc-e-Boc-賴 氨酸巧mmol)、DCC化mmol)和N服巧mmol)在CHzCkTHF1:1中在(TC綴合20分鐘，然后在 室溫綴合過夜。通過巧=酬測試的陰性確定反應完成。通過冷酸和乙醇沉淀法純化單甲氧 基陽G日,。。。-賴氨酷基-[賴氨酷基-(a-Fmoc-e-t-Boc賴氨酸）2]2，TFA去保護，然后酸沉 淀和洗涂得到陽G-賴氨酷基-[賴氨酷基（a-Fmoc-e-畑2-賴氨酸）2]2。最后，用油酷氯 (Smmol)、TEA(IOmmol)封端20分鐘，然后酸和乙醇沉淀和洗涂得到79%收率的4。電醒 R5 7. 36-7.：M(m, 32H)，5. 35-5. 27 (m, 8H)，5. 14-5. 09 (m, 7H)，4. 27-4. 22 (m, 6H)，3. 70-3. 61(PEG峰），3. 41 (s, 3H)，3. 21-3. 07 (m, 9H)，2. 01-1. 97 (m, 9H)，I. 49-1. 23 (m, 130H)，0. 89 扣 細).
[0129] 甲氧基陽G2,。。。-a-Cbz-e-油酷基賴氨酸巧）、陽G2, 000-a-Cbz-賴氨酷 基-a-Cbz-e-油酷基賴氨酸（6)、甲氧基陽Gz,。。。-a-Cbz-賴氨酷基-a-Cbz-賴氨酷 基-a-Cbz-賴氨酷基-e-油酷基賴氨酸（7)和甲氧基PEGz,。。。-氨基甲酯基-1-棟桐酷 基-2-油酷基-Sn-甘油-3-憐脂酷乙醇胺（PEG-POP巧（8)。將S種具有不同數目a-Cbz-賴 氨酸殘基和單油酷基鏈的PEG-賴氨酷基-脂質綴合物類似于1地合成并純化，除了使用 曰-Cbz-e-Boc-賴氨酸代替a-Fmoc-e-Boc-賴氨酸用于1至3個重復周期。將對照表面 活性劑PEG2。。。-油酸醋通過將甲氧基PEGz,。。。與油酷氯和TEA反應來制備；且PEG-憐脂綴合 物通過將被光氣活化的甲氧基PEGz,。。。與POPE和TEA反應，然后酸沉淀來合成。
[0130] 脂膚 5 的電NMR:古NMR5 7. 29-7. 19 (m, 5H)，5. 23-5. 22 (m, 2H)，4. 98-4. 95 (m, 2H) ，4.12-4.10(111，1巧，3.56-3.52任66峰），3.26(3,3巧，3.21-3.17(111，2巧，2.09-1.88(111，6巧， 1.27-1. 16 (m，28H), 0.77 (t，3H)。
[0131] 脂膚 6 的電NMR:1hNMR5 7. 37-7. 29(m,IOH), 5. 37-5. 35(m, 2H), 5. 12-5. 09(m，4H )，4. 25-4. 22 (m, 2H)，3. 70-3. 64(PEG峰），3. 40 (s, 3H)，3. 21-3. 17 (m, 4H)，2. 03-1. 89 (m, 6H) ，I. 40-1. 24 (m, 34H)，0. 90 (t, 3H)。
[013引 脂膚 7 的電NMR:1hNMR5 7. 36-7. ：M(m，15H), 5. 35-5. ：M(m，2H), 5. 14-5. 09(m，6H )，4. 27-4. 22 (m, 2H)，3. 70-3. 61(PEG峰），3. 39 (s, 3H)，3. 21-3. 07 (m, 6H)，2. 01-1. 97 (m, 6H) ，I. 49-1. 23 (m, 40H)，0. 89 (t, 3H)。
[013引 化合物 8PEG-P0陽的古NMR:古NMR5 5. 35-5.：M(m, 2H)，3. 69-3. 64(PEG峰），3. 92 -3. 96 (m, 4H), 3. 57-3. 55 (m, 2H), 3. 39 (s, 3H), 2. 29-2. 28 (m, 2H), 1. 37-1. 27 (m, 50H), 0. 89(t，3H)。
[0134] 1(d).臨界膠束濃度（CMC).當并入膠束核屯、的更疏水性的微環境時，基于伊紅-Y 的最大吸收的紅移測定CMC。將伊紅Y溶液添加至在蒸饋水中制備的一系列表面活性劑溶 液至ImM的最終濃度且在室溫下解育30分鐘。測量0Dm2?并對表面活性劑濃度繪圖，從中 可W估計CMC的值。
[0135] 1 (e).含或不含JP4-039的膠束制劑的制備。通常通過氨基酸衍生物或脂膚的干 燥薄膜與具有恒定滿流的合適的水溶液水合制備膠束，直至形成透明溶液。最終濃度大約 是100-200mg/mL。首先將脂膚、氨基酸衍生物或氮氧化物化合物溶于氯仿中。將溶液等分 至玻璃測試管中，混勻，然后用恒定氮氣流吹掃W去除大部分溶劑。通過應用2小時高真空 去除殘留的溶劑。為了測定JP4-039的膠束促進的增溶作用，使用表面活性劑與藥物的各 種摩爾比來在水中制備表面活性劑-藥物混合物（JP4-039的最終濃度是5mg/mL)。至少 30分鐘后，將樣品W1300化pm短暫離屯、。回收一半的上清液，向其中添加等體積的乙醇W 溶解/破壞膠束藥物復合物。使用〇〇44??定量樣品中的藥物量。
[0136] 1(f).粒徑測量。為了評估膠束顆粒的水力粒徑，在蒸饋水中從干燥膜制備表 面活性劑溶液（含或不含并入的藥物）。在蒸饋水中將樣品再稀釋十倍且使用粒徑儀 (ZetasizerNanoZS儀器，來自MalvernInstrumentsLtdofWorcestershire,英國） 由激光動態光散射測量粒徑。在鹽水中稀釋100倍后使用CoulterM粒徑儀進行乳劑顆 粒的粒徑測量。
[0137] 1 (g).脂膚4膠束和脂膚4-JP4-039復合物的化yo-EM。通過水合最終濃度為 lOOmg/mL的蒸饋水中的干燥脂膚膜來制備膠束。檢查的樣品是單獨的脂膚4 (A)和W1. 6:1 的摩爾比制備的脂膚4-JP4-039復合物度）。將在蒸饋水中稀釋5倍的4yL樣品立刻用 于帶孔的Quantifoil網格（來自QuantifoilMicroToolsofJena,Germany)，用濾紙涂 布并使用FEIVitrobotTMMarkIII(來自FEIofHillsboro,Oregon)在液體乙焼中快速 冷凍D在 4KX4KGatanCCD相機（來自Gatan,Inc.ofWarrendale,Pennsylvania)上米 集低劑量（K)~15e-/A^投影圖像，該相機具有陽ITecnaiTF20電子顯微鏡（標稱 29000至50000的放大率和1. 0至2. 5ym的弱焦點值）。
[0138]使用GatanDigitalMicrogra地軟件（來自Gatan,Inc.ofWarrendale,F*ennsyl vania)中的密度圖工具測量脂膚4管狀膠束的直徑（算作~100)和條形JP4-039-脂膚4 混合膠束的長度（算作~240)。
[0139] 用于選擇的脂膚的冷凍電子顯微鏡（C巧O-EM)圖像證實在20mg/血的3(未 顯示）和4(圖3A和3B)中存在具有長管形狀的自組裝結構。管狀結構具有厚度為 208-4.0皿(3. 5 + 0. 4皿，n= 22)的電子-光中屯、區，可能是由脂質鏈組成的膠束核屯、。光 核屯、被高電子致密的外圍壁包圍，可能是含有Fmoc-賴氨酸的界面區域。從高致密壁的中 間點之間的距離測量管狀結構的平均直徑是~5. 6 + 0. 4nm。高電子致密區域的厚度是電 子-光中屯、區域厚度的~1/3至1/2。陽G鏈的電子致密不足W用cryo-EM顯示。顯示在 脂質體表面上的報道的脂質錯定的PE^,。。。-陽綴合物的厚度是10-15nm。假設該參數應用 于運些管狀陽G-脂膚膠束，包括陽G層的總直徑會在27-40nm的范圍內。
[0140] 負載JP4-039的膠束顯示出明顯減少的粘度。用激光動態光散射方法測量的負載 JP4-039的陽G-脂膚4的粒徑也小于空膠束（表4)。當JP4-039存在時，C巧O-EM圖像顯 示出許多小圓點（~90%，n= 388,圖3B)和截短的條狀結構（~10% )的混合物。小 圓點和條的直徑略小于在單獨脂膚樣品中觀察到的管狀膠束的直徑。條結構的長度在~30 至300nm之間變化，平均長度在60nmW下。在cryo-EM上的負載JP4-039的膠束的粒徑分 布與由激光動態光散射獲得的結果一致。沒有游離藥物的晶體的跡象（參見圖3B)。
[0141] 1化).巧光澤滅研究。用含有0、0. 25或0. 5mgJP4-039的IOmg脂膚4通過在 300y1鹽水中水合的方法制備含有或不含有JP4-039的膠束制劑。使用SOOnm的激發波 長和從350皿至500皿的不同的發射波長在Synergy化Hybrid讀取器（來自BioTekof Winooski,Vermont)上記錄巧光強度。
[014引l(i).膠束制劑的古NMR譜。在含有IOOmM化Cl(對于脂膚4)或IOOmMK肥03(對 于a-Fmoc-e-Boc-賴氨酸）的020中，從脂膚4或a-Fmoc-e-tBoc-賴氨酸（含有或 不含有JP4-039或4-乙酷胺-TEMPO)制備膠束。使用化址er400MHzNMR(來自化址er ColorationofBillerica,Massachusetts)記錄IrNMR譜并且使用 20 秒的循環脈沖延 遲W確保精確的質子積分。對于起初的實驗，d-DMSO用作可選溶劑。
[0143] 1 (j).溶血試驗。通過用10倍體積的冷PBS洗涂S次（150化pmlO分鐘）從添 加有抗凝劑的新鮮收集的大鼠血液中分離大鼠紅細胞（RBC)。然后將RBC用冰冷的DPBS稀釋至2%w/v并立即用于溶血試驗。分別用不同濃度（O-SmM)的陽G-脂膚、吐溫80和 TritonX-IOO處理一毫升稀釋的RBC懸浮液，然后在解育箱搖床上在37°C解育化。4°C下W 1500巧m離屯、樣品10分鐘，并且將來自每個樣品的100yL的上層清液轉移至96孔板。通 過使用微板讀取器在540nm的吸收度測定血紅蛋白的釋放。分別用化itonX-IOO和DPBS 處理的RBC被認為是陽性或陰性對照。將血紅蛋白釋放計算為伽樣品-OD剛生刷胥）/伽陽性對 照-OD陰性對照）X100 %。
[0144] 1化).JP4-039的乳劑制劑和穩定性。將JP4-039 (4mg)配制在由芝麻油（IOOmg) 和大豆憐脂酷膽堿巧Omg)組成；或由芝麻油（lOOmg/mL)、大豆憐脂酷膽堿（40mg)與共 表面活性劑陽G2,dw-油酸醋（29. 6mg/mL，0. 0128ymole)、陽G2,DDD-a-CBz-e-油酷基賴 氨酸（32. 5mg/mL0. 0128ymole)、陽Gz.ooita-CBz-a-CBz-e-油酷基賴氨酸（35. 9mg/ 血,0. 0128Jimole)或陽G2,。。。-a-CBz-賴氨酷基-a-CBz-賴氨酷基-a-CBz-e-油酷基 賴氨酸（39.3mg/mL，0.0128ymole) -起組成的乳劑中。將所有組分溶于氯仿中，混勻，并 然后再成氣流下去除溶劑，然后真空干燥2小時。將油性殘余物懸浮于鹽水中，在Nz氣 流下用具有20mW的最大輸出的探頭超聲波儀在冰浴下超聲60分鐘，直至粒徑減小至低于 150-250nm。通過激光動態光散射法（CoulterMparticlesizer)評估初始粒徑。在低速 離屯、W去除樣品中的任何沉