Salipro顆粒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及脂蛋白顆粒，其用作疏水試劑（如疏水性藥物或膜蛋白）的遞送或載 體系統，本發明還設及用于制備該盤狀脂蛋白的方法。
【背景技術】
[0002] 膜蛋白和疏水性的化合物非常難W處理，并且制藥和生命科學研究和應用中具 有兩個主要的挑戰：（i)為不可溶的疏水化合物或膜蛋白提供在水溶液中的可溶性，W及 (ii)將運類疏水性物質作為治療劑和診斷劑施用。
[0003] 膜蛋白由全部ORF的大約30%編碼（參見文獻"WallinandvonHeiJne,Protein Science1998Apr;7 (4) : 1029-38")，并且由于大部分（即，大于60% )藥物實際上革己向 運類蛋白，因此其代表了一類重要的藥物祀點（參見文獻"Overingtonetal.，化化re ReviewsDrugDiscovery5, 993-996(December2006)")。膜蛋白在許多生物過程中發揮 重要作用，如信號轉導、分子和能量運輸、識別和細胞通訊。然而，當將膜蛋白從其天然脂雙 層環境中提取出來后，膜蛋白由于其不溶性和趨于聚集的性質而難W研究。為了維持膜蛋 白的完整性，需要人造的疏水環境。在此，去垢劑膠束是最常使用的，然而其會對生物相容 性產生負作用，能夠對膜蛋白的活性產生不利影響，并且可能會干擾檢驗的實驗條件。
[0004] 另一個主要的藥理學挑戰是，施用和遞送疏水性化合物和/或疏水性蛋白作為治 療劑或診斷劑。由于運些疏水性試劑的溶解度有限，它們趨于聚集，運將導致局部藥物顆 粒濃度高，從而會導致高的毒性、不希望的免疫反應，并且會使藥物失活（參見文獻"Allen andCullis,SCIENCE, 303 (5665) :1818-1822,MAR19,2004")。
[0005] 因此，非常需要將諸如膜蛋白、藥物或診斷化合物等疏水試劑納入可溶性的顆粒 中的應用。目前，解決運兩個挑戰的方法主要設及脂質體和重組高密度脂蛋白（r皿L)顆粒 (參見文獻"QianandBoxer,QirrentOpinioninchemicalBiology11:1-7, 2007")。
[0006]EP1596828B1公開了盤狀生物活性試劑運送顆粒，包含W雙帶樣形式緊密包圍脂 雙層的載脂蛋白。上述顆粒的內部由脂雙層的疏水區域形成。運與具有含水內部的封閉球 狀雙層殼的脂質體不同。EP1596828B1中公開的盤狀生物活性試劑運送顆粒的斯托克斯直 徑約為IOnm,并且提出了將其用作疏水性藥物如兩性霉素B或喜樹堿的遞送載體。
[0007]EP1345959B1公開了相似類型的直徑約10皿、高度約5. 5皿的納米顆粒。該顆粒 為盤狀，并且由（i)人工膜腳手架蛋白、（ii)憐脂雙分子層和（iii)至少一種疏水性或部 分疏水性膜蛋白組成。所述膜腳手架蛋白也W雙帶樣式包圍脂雙層，并且是人載脂蛋白A-I 的衍生物或截短形式，缺少人載脂蛋白A-I的N-末端球狀結構域，其是兩親性的并且形成 至少一個a螺旋，并且在水環境中會與憐脂或憐脂的混合物自組裝成所述盤狀的納米顆 粒。運種工程化的膜腳手架蛋白（MS巧將為納米級盤狀脂蛋白顆粒提供穩定性、尺寸均勻 性W及有用的功能性。
[0008] 然而，目前可用的納米盤技術存在一些缺點，例如，在顆粒的組裝過程中需要去除 去垢劑。除此之外，在現有技術的方法中，由載脂蛋白衍生的MSP的緊密雙帶樣形式提供的 尺寸均勻性似乎導致了運樣的代價：固定的最小顆粒尺寸，和限制了可獲得的最大直徑。
[0009] 銷脂激活蛋白（saposin)家族包括4種小（大約80個氨基酸）蛋白，包括銷脂激 活蛋白A到D，其與脂結合和/或相互作用，并且在銷脂代謝中作為一些溶酶體酶的重要輔 因子（參見"化化n，BiochemJ. (2005) 389, 249-257"和其所引用的文獻）。據描述，銷脂激 活蛋白更偏好帶負電荷的脂質和低抑值，在酸性抑環境中顯示出明顯提高的活性，最佳抑 值為溶酶體內4. 75的抑值。銷脂激活蛋白A、B、C和D由單一的大的前體蛋白銷脂激活 蛋白原（prosaposin)通過蛋白水解作用水解而得。已經報道了銷脂激活蛋白A、B、C和D 的完整氨基酸序列、化及銷脂激活蛋白原的基因組結構和CDNA序列（請參見"0'化ienet al. (1988)Science241, 1098-1101 !F^irst等（1992)BiochimBio地ysActa1126:1-16")。
[0010] 銷脂激活蛋白C在酸性環境中能夠誘導含憐脂的載體發生膜融合（參見 "ArchivesofBiochemistryandBiophysics2003Jul1;415(1) :43-53"),其他銷脂激 活蛋白沒有表現出該特征。文獻"Qietal. (2009)ClinCancerRes15(18):5840 - 5851" 報道了銷脂激活蛋白C偶聯的二油酷基憐脂酷絲氨酸納米載體（SapC-DOP巧，其具有含水 內部、大約190nm的平均直徑，并且在體內表現出腫瘤祀向活性。在SapC-DOPS中，銷脂激 活蛋白C或其衍生膚作為其結合的脂質體的導向膚化omingP巧tide)。銷脂激活蛋白C而 后祀向脂質體到細胞膜外葉暴露有憐醋酷絲氨酸的癌細胞。作者認為，由于溶酶體酶的細 胞外泄漏而導致的癌細胞周圍的獨特酸性微環境使得腫瘤組織成為銷脂激活蛋白C的最 佳祀標。根據Qi等人所述，SapC-DCPS溶酶體通過W下方法制備：在N2(g)下干燥溶劑溶 解的憐脂，將干燥的憐脂分散在含有純化的銷脂激活蛋白C的酸性緩沖液（pH5)中，在生 理水溶液中將混合物稀釋50倍，W及通過后續的超聲處理促進納米載體組裝。
[0011]文獻叩opovicetal. ,PNAS,Vol. 109,No. 8 (2012) 2908-2912"報道了銷脂激活蛋 白A去垢劑盤的結構。銷脂激活蛋白AW可溶的、脂/去垢劑-結合的狀態存在。在脂質 缺乏時，銷脂激活蛋白A采取封閉的無配體（apo)構象。相反，Popovic等報道的銷脂激活 蛋白A去垢劑盤結構顯示了開放構象的銷脂激活蛋白A的兩條鏈，其包裹了 40個內部結合 的去垢劑分子，它們被組織在高度有序的雙層樣疏水核屯、中。
[0012] 除了銷脂激活蛋白A去垢劑盤的結晶作用，Popovic等還描述了可溶性脂-銷脂激 活蛋白A復合物的制備，其在4. 75的抑下通過需要多步的方法進行。首先，通過如下方式 制備均勻級分的大單層脂質體載體：在N2(g)下干燥用氯仿溶解的脂質，通過滿旋混合將干 燥的脂質分散在酸性緩沖液巧OmM乙酸鋼抑4.8,150mM化Cl)中，對懸浮液進行10個凍 融循環，在滿旋混合器中混合5分鐘，將混合物擠壓通過200nm過濾器。在酸性緩沖液中將 由此制備的大單層脂質體載體與純化的銷脂激活蛋白A混合，由此獲得可溶的脂質-銷脂 激活蛋白A顆粒。該顆粒表現出窄的尺寸分布，即，大約平均3. 2nm的流體動力學（斯托克 斯）半徑，并且每個銷脂激活蛋白A鏈含有大約5:1的脂質分子。顆粒的精確大小僅適度 地受到脂質與蛋白的摩爾比W及脂質體的組成的影響。無論在脂質體混合物中是否存在陰 離子憐脂、膽固醇或銷糖脂，作者均觀察到了相似的3. 2nm的顆粒。在所有情況下，在3. 2nm 斯托克斯半徑的尺寸范圍內觀察到了單一的峰，運提示了相對窄的種類分布。因此，該文獻 公開的技術限制于4. 75的抑值、上述顆粒大小W及包括繁復的上游脂質體制備步驟。
[0013] 在該背景下，需要一種可靠且易于實施的制備穩定的特定脂蛋白-顆粒組合物的 方法，W使膜蛋白和其他疏水化合物溶液化。考慮到現有技術中所公開的用于制備盤狀脂 蛋白顆粒的方法費事且具有多個步驟，因此尤其具有運樣的需求。
[0014] 多種疏水試劑能夠潛在地從現有技術中記載的載脂蛋白-或銷脂激活蛋白A-衍 生的納米盤技術中獲益。然而，由于銷脂激活蛋白A衍生顆粒具有3. 2nm大小的限制，似乎 (如果有的話）只有小分子可W在其中所公開的酸性抑值下被納入所述顆粒。盡管體積大 的疏水化合物和大的生物分子如（寡聚）膜蛋白能夠被納入現有技術中的載脂蛋白A衍生 的納米盤，但是可行的最大直徑仍然受到運些顆粒的雙帶樣載脂蛋白A的周長的限制。此 夕F，IOnm的載脂蛋白A衍生納米盤對于某些應用而言可能過大。因此，需要先進的納米盤技 術和更優的具有靈活可控的尺寸范圍的脂蛋白顆粒，使得能夠適應待被納入脂蛋白顆粒中 的疏水試劑的各自的尺寸。運樣的顆粒應當可W簡單地整合膜蛋白和其他疏水組分，所述 其他疏水組分例如可W為具有藥學或生物學活性的化合物或診斷化合物。
【發明內容】
[0015] 本發明所要解決的問題是提供一種納米級脂蛋白顆粒，其大小可控和/或其大小 適應于被納入的分子的性質，并且其易于制備并且隨著時間的推移能夠保持均一的大小、 品質和組成。
[0016] 該問題通過運樣的顆粒而得W解決，該顆粒包含脂質結合多膚、至少一種脂質和 一種疏水試劑，其中所述疏水試劑不同于所述至少一種脂質，并且其中所述脂質結合多膚 是銷脂激活蛋白類蛋白或其衍生物或截短形式。
[0017] 本發明還提供了一種藥物組合物或診斷用組合物，其包含本發明所述的顆粒。
[0018] 本發明還提供了用于制備包含脂質結合多膚和脂質的顆粒的方法，其中所述脂質 結合多膚為銷脂激活蛋白類蛋白或其衍生物或截短形式，并且其中所述方法包括W下步 驟：在液體環境中使所述脂質結合多膚與溶液化的脂質接觸；并且在抑值為5. 0-10下使 得自組裝成所述顆粒。
[0019] 最終，本發明所述顆粒能夠作為疏水試劑遞送載體、作為藥物研發、藥物篩選、膜 蛋白研究的工具、W及作為疫苗接種制劑。
[0020] 不限于此理論，疏水試劑與脂質W及銷脂激活蛋白類蛋白或其衍生物或截短形式 的結合看來提供了堅固的結構，其在廣泛抑范圍（特別是生理抑值）的水性溶液中穩定 存在，并且使得能夠獲得比現有技術中3. 2nm的銷脂激活蛋白A衍生的脂蛋白顆粒更大的 顆粒。本發明所述的顆粒是通過本發明的方法獲得的，該方法在抑5.0至10下操作，運樣 使得能夠自組裝成本發明所述的顆粒。
[0021] 能夠通過本發明所述方法獲得的銷脂激活蛋白類蛋白-脂蛋白顆粒（本文稱為 "Salipro顆粒"）在多個特征上與現有技術中的顆粒不同，例如，它們具有內在的尺寸可變 性，并且能夠適應于待被納入脂蛋白顆粒中的疏水試劑的各自的尺寸。
[0022] 與銷脂激活蛋白-脂蛋白顆粒應當在或接近于銷脂激活蛋白的最佳4. 75的天然 抑值下進行最佳的組裝的預期不同，發現在制備銷脂激活蛋白-脂蛋白顆粒的過程中，保 持更加中性或堿性的抑能夠獲得具有改進的性能和更廣的應用范圍的銷脂激活蛋白-脂 蛋白顆粒。令人驚訝的是，發現在抑從5. 0到10W及存在溶液化的脂質時，純化的銷脂激 活蛋白類蛋白或其衍生物或截短形式自組裝成穩定的脂蛋白顆粒，而不需要繁瑣的上游脂 質體制備步驟。當嘗試在銷脂激活蛋白的最優4. 75的天然抑下或者在缺乏脂質下進行顆 粒的組裝時，該簡單且可靠的制備方法不能獲得滿意的結果。
[002引本發明所述Salipro顆粒被證明在生理抑值下能夠納入各種脂質、膜蛋白和疏水 化合物，從而產生在水性環境中可溶且穩定的納米復合物。
[0024] 本發明所述Salipro顆粒在經受標準離屯、過濾單元進行濃縮、W及冷凍和解凍時 是堅固的。此外，實際實驗表明本發明所述Salipro顆粒展現出一定程度的熱穩定性。除 此之外，可W對本發明所述顆粒進行冷凍干燥、儲存和再水化，而不會觀察到任何大的品質 劣化。
【具體實施方式】
[0025] 脂質結合多膚是銷脂激活蛋白類蛋白（SAPLI巧或其衍生物或截短形式。本文 所用的術語"銷脂激活蛋白類蛋白"（SAPLI巧是本領域熟知的，并且包括脂質相互作用蛋 白的銷脂激活蛋白類蛋白（SAPLI巧家族的所有成員。SAPLIP家族的特征是具有銷脂激 活蛋白折疊，其為通過高度保守的分子內二硫鍵保持穩定的保守的a螺旋=維結構（參 見文獻"Munford等.（1995)，JournalOf LipidResearch,vol. 36,no. 8, 1653 - 1663" 和"Bruhn(2005)，BiochemJ389(15) :249 - 257")。本發明所述的銷脂激活蛋白類 蛋白（SAPLIF0 家族的成員的例子在文獻"Munfordetal. (1995),JournalofLipid Research,vol. 36,no. 8, 1653 - 1663"和"化uhn(2005)，BiochemJ389 (15) : 249 - 257"中 有所描述，在此通過引用的方式將其全部內容并入本文。
[002引在無配體（即，無去垢劑/無脂質）的"封閉"狀態下，SAPLIP采取單體緊湊四 螺旋束型結構，即，銷脂激活蛋白折疊。該折疊可W列舉W下結構：人脂激活蛋白A的封閉 無配體形式的結構（蛋白數據庫（PDB)ID編號：2D0B，參見"Ahnetal. (2006)Protein Sci.l5:1849-1857")或銷脂激活蛋白C的結構（PDBID編號：lM12;參見"deA化aet al. (2003)Biochemist巧 42, 14729 - 14740")、NK-細胞溶素的結構（PDBID編號：INKL;參 見"Liepinshetal. (1997)化t.Struct.Biol. 4, 793 - 795")、阿米己穿孔素A(amoebapore A)的結構（PDBID編號：10F9)和顆粒溶素（granulysin)的結構（PDBID編號：1L9L;參 見"Andersonetal. (2003)J.Mol.Biol. 325, 355 - 365")，它們的結構均幾乎相同并且易 于重疊（super-impos曰ble)。
[0027] SAPLIP在結合至配體（例如脂質或去垢劑分子）后發生構象變化。在配體結合 "開放"構象中，SAPLIP采取V形或飛旋標形構象，暴露出與所結合的脂質接觸的疏水表 面。該開放構象可列舉W下結構：現有技術中的銷脂激活蛋白A去垢劑盤結構（PDB ID編 號：4孤J ;參見叩opovic等.，PNAS, Vol. 109, No. 8 (2012) 2908-2912")、和結合至SDS去垢 劑膠束的銷脂激活蛋白C的結構（PDB ID編號：1SN6 ;參見"Hawkins et al. (2005)J.M〇1. Biol. :346:1381-1392")。
[0028] 在本發明的顆粒中，脂質結合多膚優選為兩親性的，其結構的一部分或多或少是 親水的并且面向水性溶劑，另一部分或多或少是疏水的并且面向所述顆粒的包含脂質的疏 水中屯、。脂質結合多膚優選具有如下特點：具有運樣的兩親性a螺旋，其具有更多的主要 位于螺旋的一面上的疏水殘基（如A、C、F、G、I、LM、V、W或Y)、W及更多的位于螺旋的另 一面上的極性或帶電荷的殘基（如D、E、N、Q、S、T、H、K或時。
[0029] 本文所述氨基酸殘基的縮寫如下：A，Ala,丙氨酸；V，Val,鄉氨酸山Leu,亮氨 酸；I，lie,異亮氨酸；P，Pro,脯氨酸；F，化e，苯丙氨酸；W，化p，色氨酸；M，Met,甲硫氨酸；G，Gly,甘氨酸；S，Ser,絲氨酸；T，1'虹，蘇氨酸；C，切S，半脫氨酸；Y，Tyr,酪氨酸；N，Asn, 天冬酷胺；Q，Gln,谷氨酷胺；D，Asp,天冬氨酸化Glu,谷氨酸；K，Lys,賴氨酸；R，Arg,精 氨酸；和H,化S,組氨酸。
[0030] 與現有技術中的載脂蛋白衍生納米盤不同，本發明所述脂質結合多膚不W雙帶樣 形式包封脂質（參見圖1)，相反，本發明所述顆粒通過包含脂質的核屯、保持在一起，所述 脂質被兩個或更多個近似V形或飛旋標形狀的W頭-尾方向排列的脂質結合多膚圍繞，并 且在本發明所述顆粒中，每個所述脂質結合多膚之間實質上沒有直接的蛋白與蛋白的接觸 (參見圖2-7)。希望不限于理論，認為本發明的顆粒中的脂質結合多膚和脂質的運種排列 方式提供了尺寸可變性，運在體積大的疏水試劑或量增加的脂質被納入本發明的顆粒中時 可W觀察到。
[0031] 盡管SAPLIP具有與脂質相互作用的能力W及上述的兩親性性質，并且S維結構 高度保守，但是它們在氨基酸序列水平上是高度多變的，其序列同一性低于定義同源性通 常所用的 25-30% 同一性的闊值范圍（參見"化Uhn(2005),BiochemJ389(15):249 - 257" 的圖4A和4B中的序列比對，本文W引用方式特別將其附圖并入本文）。
[0032] 在本發明所述脂蛋白顆粒中，脂質結合多膚主要作為結構蛋白，為本發明所述脂 蛋白顆粒提供盤狀結構框架。由于運個原因，與僅僅為序列決定相比，結構特征、特別是 SAPLIP的銷脂激活蛋白折疊運一特征對于限定本發明的脂質結合多膚更加重要。
[0033] 本發明所述SPLIP的例子為銷脂激活蛋白A、B、C或D(例如W下來源的：人Olomo sapiens)[參見沈QIDNO. 1-4]、馬巧quusC油alius)、牛度OStaurus)、小家鼠（Mus mus州Ius)、家兔（Oryctolagus州ni州Ius)、大家鼠（Rattusnorvegicus)或非洲爪贍 狂enopusIaevis));表面活性蛋白B(例如W下來源的：人、家犬（Canisfamiliaris)、 小家鼠、家兔、綿羊（Ovisaries)或大家鼠）；粒溶素（例如人源的，參見SEQIDNO. 5); NK細胞溶素（如野豬（Susscrofa)源的；參見SEQIDNO. 6) ;NK細胞溶素直系同源 物（Odhologues)(如馬或牛來源的）；阿米己穿孔素（如溶組織內阿米己巧ntamoeba histolytica)來源的）；阿米己穿孔素直系同源物（如迪斯帕內阿米己巧ntamoeba dispar)或侵襲內阿米己巧ntamoebainvadens)來源的）；阿米己穿孔素樣蛋白（如肝 片吸蟲（Fasciolahepatica)來源的）；耐格里屬阿米己穿孔素（化egleriapores)(如福 氏耐格里阿米己（化egleriafowleri)來源的）；Clo;rno;rin(如華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis)來源的）；銷脂激活蛋白原（如人、馬、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪贍來源 的）和MSAP(如人源的）。
[0034] 本發明所用的特定的SAPLIP的序列在文獻"化Uhn(2005)，BiochemJ389(15): 249-257"的圖4A和4B中給出，其中所述附圖和序列特意通過引用方式并入本文。本發明 所用的特定SAPLIP的序列在如下序列中給出：SEQIDNO. 1銷脂激活蛋白A[人];SEQID N