通過序列特異性轉肽酶制備免疫配體/效應分子結合物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及制備免疫配體/效應分子（payload)結合物的方法。
【背景技術】
[0002] 目前用于標記蛋白和/或將分子結合至蛋白（尤其是當涉及小分子效應分子或標 記時）的主要方法，包括在化學結合（conjugation)中使用特異性連接子（linker)分子， 將效應分子共價連接至蛋白質的自由賴氨酸和/或半胱氨酸。
[0003] 但是，許多蛋白質，例如免疫靶向策略中尤為感興趣的抗體，都是較大的蛋白質， 可能包含多個賴氨酸和半胱氨酸殘基。由于連接子介導的化學結合是一種隨機過程，因此， 連接子介導的效應分子化學連接反應得到的是結合蛋白的不同種混合物，其在療效和/或 診斷用途上可能不同。顯然，蛋白-效應分子結合物還給治療性結合物的常規審批流程帶 來了顯著困難，因為出于潛在安全顧慮，有關管理部門對其批次差異和/或活性藥學成分 (API)差異存在負面看法。
[0004] 此外，若期望限定蛋白負載的效應分子比例，則常需要根據期望的結合化學計量 配比來純化結合物。這不僅枯燥，而且可能限制提高生產過程中的商品成本，因為通常僅 有部分連接子介導的結合蛋白具有期望的效應分子比例。對治療相關的抗體/藥物結 合物（ADCs)而言尤為如此，其中根據所用的毒素，3-4個毒素分子似乎較為有利，但在典 型的連接子介導的化學結合反應中，存在每個抗體結合0-8個毒素的情況（Panowski et al. (2014)) 〇
[0005] 雖然存在上述缺陷，目前臨床測試中所用的或由衛生部門批準用于疾病治療的 全部抗體/藥物結合物，都是毒性小分子藥物與抗體通過連接子介導的化學結合獲得的 (Lambert (2012)或 Milliard(2013)).。
[0006] 本領域的工業和科學專家們普遍認同，分子效應分子（包括毒性或標記分子）與 免疫配體的位點特異性化學計量配比結合，與連接子介導的化學結合反應相比，具有顯著 優勢。因此，存在以蛋白質結構中特定氨基酸作為化學結合反應目標的嘗試（Panowski et al. (2014)) 〇
[0007] -方面，嘗試通過蛋白質結構中某些位置上的突變，來刪除多余結合位點和/或 提供作為連接子連接反應目標的期望結合位點（例如，賴氨酸和/或半胱氨酸殘基）。
[0008] 另一方面，嘗試通過在某些位點加入非天然氨基酸，例如硒代半胱氨酸、對疊氮基 苯丙氨酸或乙酰苯丙氨酸（Hofer et al. (2009) ,Axup et al. (2012)，或Lemke (2011))，以 控制化學結合反應。
[0009] 但是，所有這些途徑都改變了將結合的蛋白質主要氨基酸序列，可能造成不期望 的功能性質。此外，上述非天然氨基酸的加入通常效率低下，且不能夠對蛋白定量加入特異 性標記位點。
【發明內容】
[0010] 因此，存在克服隨機結合方法的已知問題的迫切產業需求，尤其是對于治療相關 的免疫結合物的制備，包括但不限于ADCs。
[0011] 因此，本發明的目標之一，在于提供一種聯合免疫配體和效應分子（例如藥物、毒 素、細胞因子、標記等）以制備位點特異結合抗體藥物結合物的高效方法，優選為將全長單 克隆抗體結合至小分子量毒素。
[0012] 本發明的又一目的在于，制備療效更佳和/或生產再現性更高的免疫配體/效應 分子結合物。
[0013] 本發明的又一目的在于，允許以位點特異性和/或序列特異性方式，將效應分子 與免疫配體結合。
[0014] 本發明的又一目的在于，制備保存其組成部分的特征性質的免疫配體/效應分子 結合物，例如靶向親和性、靶向特異性、靶向敏感性、溶解性、藥理學功能等。
[0015] 上述目的通過獨立權利要求的主題達成，同時，其優選實施方式進一步公開于從 屬權利要求及說明書中。
[0016] 概念定義
[0017] 本申請所稱術語"免疫配體"意在限定一種對指定目標（例如受體、細胞表面蛋 白、細胞因子等）具有親和性的實體、藥劑或分子。可選地，所述免疫配體可以阻斷或降低 激動劑介導的應答，或抑制受體-激動劑相互作用。但是，最重要的是，該免疫配體可用作 將效應分子遞送到特異位點的穿梭載體，所述特異位點由所述免疫配體所識別的標靶所限 定。因此，免疫配體以例如但不限于一種受體為標靶，將其效應分子遞送至以含有大量所述 受體為特征的位點。免疫配體包括但不限于，抗體、抗體片段、給予抗體的結合蛋白、擬抗 體、受體、可溶性誘餌受體、對指定標靶具有親和性的支架蛋白，以及受體的配體。
[0018] "抗體"，以及其同義詞"免疫球蛋白"（Ig)通常包含4條多肽鏈，其中有2條重鏈 (H)和2條輕鏈（L)，因此是多亞基蛋白或其等同Ig同系物（例如，含有僅一條重鏈的駱 駝科納米抗體，可源于一條重鏈或輕鏈的單域抗體（dAbs));包括全長功能性突變體、變體 或其衍生物（包括但不限于，鼠科抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體，其能夠保存Ig 分子的必要表位結合特征），還包括雙特異性、多特異性和雙可變域免疫球蛋白，免疫球蛋 白分子可以是任何種類（例如，IgG, IgE, IgM, IgD, IgA,和IgY)或子類（例如IgGl，IgG2， IgG3, IgG4, IgAl，和IgA2)和同種異型體。
[0019] 本申請所稱的"基于抗體的結合蛋白"可以指其他非免疫球蛋白或非抗體衍生成 分的情況中，任何包含至少一個抗體衍生的VH，\，或Ch免疫球蛋白域的蛋白。所述基于抗 體的蛋白包括但不限于，（i)結合蛋白的F。-融合蛋白，包括具有部分或全部免疫球蛋白Ch 域的受體或受體成分了；（ii)VjP/或V 或連接替代性分子骨架的結合蛋白；或（iii)含 有以通常不存在于天然抗體或抗體片段中的方式結合和/或組裝的免疫球蛋白％和/或 或的分子。
[0020] 本申請所稱的"抗體藥物結合物"（ADC)指的是與小分子量活性藥學成分（API) 連接的抗體或抗體片段或基于抗體的結合蛋白，其中API包括但不限于毒素（包括，例如， 但不限于，微管蛋白抑制劑、肌動蛋白粘合劑、RNA聚合酶抑制劑、DNA插入和修飾/破壞藥 物）、激酶抑制劑或任何干擾細胞生存必需的和/或特定生理細胞通路必需的特定細胞通 路的API。
[0021] 本申請所稱的"抗體衍生物或片段"指的是包含至少一種源于非全長抗體的多肽 鏈的分子，包括但不限于：（i)Fab片段，其為由輕鏈可變域（\)、重鏈可變域（V H)、輕鏈恒 定域（Q)和重鏈恒定域I(ChI)組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，其為包含由鉸鏈區二 硫鍵連接的2個Fab片段組成的二價片段；（iii) Fab (Fd)片段的重鏈部分，由VjP C H1域組 成；（iv)可變片段（Fv)片段，由抗體單臂上的\和V "域組成；(V)域抗體（dAb)片段，其 包含單可變域；(vi)分離的互補決定區（CDR) ; (vii)單鏈Fv片段（sc Fv) ; (viii)雙特異 抗體，其為在單一多肽鏈上表達但使用了其長度不允許同鏈兩域配對的連接子的％和Vl 域的雙價、雙特異性抗體，由此迫使所述域與另一條鏈的互補區配對形成2個抗原結合部 位；以及（ix)線形抗體，包含一對與互補輕鏈多肽共同形成一對抗原結合區的串聯F v片段 (Vh-ChI-Vh-ChI);和（X)其他免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的非全長部分，或其突變體、變體 或衍生物，或其組合。
[0022] 本申請所稱的"修飾抗體形式"包含抗體_藥物-結合物、聚亞烷基氧化物修飾的 sc Fv、單體抗體、雙體抗體、胳盤科抗體、域抗體、雙特異性或三特異性抗體、IgA，或由J鏈 和分泌片連接的2個IgG結構、鯊魚抗體、新世界靈長類骨架+非新世界靈長類CDR、移除 鉸鏈區的IgG4抗體、帶有2個改造為CH3域的附加結合位點的IgG、Fc區改變以提高對Fc 伽馬受體親和性的抗體、包含CH3+VL+VH的二聚結構，等等。
[0023] 本申請所稱的"擬抗體"指的是不屬于免疫球蛋白家族的抗體，甚至包括非蛋白， 例如適體，或合成聚合物。某些種類具有類似抗體的(6-片層結構。"擬抗體"或"替代性 骨架"相對于抗體的潛在優勢在于溶解性更好，組織滲透性更好，對熱和酶的穩定性更高， 且制備成本相對較低。
[0024] 某些擬抗體可以用大文庫提供，其中提供對每一種可能標靶的特異性結合備選 物。正如抗體，靶向特異性擬抗體可以使用高通量篩選（HTS)技術以及成熟的顯示技術（例 如噬菌體展示、西郡展示、酵母菌或哺乳類展示）來開發。目前開發出的擬抗體包括，例如， 錨蛋白重復蛋白（稱為DARPins)，C型凝集素，金黃色葡萄球菌的A結構域蛋白，轉鐵蛋白， 脂質運載蛋白，纖連蛋白第十型III結構域，Kunitz結構域的蛋白酶抑制劑，泛衍生粘合劑 (稱為affilins)，y -晶狀體衍生的粘合劑，半胱氨酸結，硫氧還蛋白A基支架粘合劑，核 酸適體，由聚合物分子印跡制得的人造抗體，從細菌基因組肽庫制得的多肽文庫，SH-3域， stradobody，以二硫鍵和基于Ca 2+、CTLA4-穩定化的膜受體的"A結構域"，Fyn SH3,以及 適體（與特定靶分子結合的寡核苷酸或肽分子）。
[0025] 當免疫配體并非蛋白或肽時，例如，若其為適體時，應當優選地令其連接肽標簽， 以為本申請公開的酶促結合反應提供適當底物。
[0026] 本申請所稱的"結合反應（conjugation) "指的是一個分子與另一個分子通過形成 共價鍵而進行共價結合。
[0027] 本申請所稱的"免疫毒素"指的是與代表毒素的蛋白或多肽結合的免疫配體，所述 毒素包括，但不限于，細菌毒素（如白喉毒素A，假單胞菌外毒素，肉毒桿菌毒素），或如來自 脊椎動物（例如，但不限于蛇），或非脊椎動物（例如但不限于蜘蛛，蝎子，軟體動物，水母） 的蛋白質毒液，或其功能片段。
[0028] 本申請所稱的"低分子量效應分子"指代分子量不超過2500道爾頓的效應分子。
[0029] 本申請所稱的"效應分子"指的是任何天然或合成制備的分子，包括可由化學合成 的小分子量分子或化學實體，和需要通過宿主細胞發酵來制備且可對標靶或抗原結合特異 性免疫配體賦予新功能的較大分子或生物實體。
[0030] 本申請所稱的"小分子量毒素"指的是分子量不超過2500道爾頓且對哺乳類細胞 具有細胞毒性的小分子量細胞毒性化合物。
[0031] 本申請所稱的"轉肽酶"是一種酶或一種酶或蛋白的催化域，其能夠催化多肽鍵 斷裂并繼而直接或通過若干反應中間體形成新多肽鍵，由此在反應中保存第一多肽鍵的能 量并將其傳遞給新的多肽鍵。優選地，所述轉肽酶優選為將一個多肽或蛋白的C端連接至 另一種肽或蛋白的N端。由于形成了新肽鍵，所述酶或功能域也稱為"蛋白連接酶"，"肽連 接酶"，或昵稱為"蛋白或肽裝訂器"。所述蛋白連接酶包括，但不限于，分選酶、內含肽和分 裂-內含肽。
[0032] 本申請所稱的"序列特異性轉肽酶"意在限定一種轉肽酶，其需要至少一個具有指 定多肽序列作為識別序列（N端和/或C端）的序列肽或蛋白，來連接所述底物肽或蛋白至 另一肽或蛋白，或包含肽或蛋白元件的小分子量化合物。
[0033] 本申請所稱的"位點特異性轉肽酶"意在限定一種在至少一個底物肽或蛋白中具 有特異性位點的轉肽酶，其使用該特異位點來結合另一肽或蛋白，或包含肽或蛋白元件的 小分子量化合物。
[0034] 發明背景及一般說明
[0035] 本申請公開了使用位點特異性轉肽酶（例如分選酶和分裂_內含肽）來位點特異 性且選擇性地將效應分子（優選為小分子量的毒素）結合至免疫配體（優選為抗體），以 生成免疫配體效應分子結合物，優選為抗體藥物結合物（ADCs)。優選的效應分子為以短鏈 (優選為小于13 (十三）個氨基酸長度）合成氨基酸序列修飾過并由此成為分選酶或分裂 內含肽介導的免疫配體N端或C端共價結合底物的小分子量毒素（圖1和圖3)。傳統上的 效應分子和免疫配體的化學結合反應是如上所述的隨機過程，與之相比，此述的結合反應 的區別性特征在于，其是以位點特異性和限定化學計量配比的形式達成的。
[0036] 本申請還公開了位點特異性轉肽酶（例如分選酶或分裂內含肽）介導的多聚體 免疫配體結合反應，優選為，抗體與2種不同的毒性分子或其他標記，使用多聚體蛋白亞基 (例如抗體的重鏈和輕鏈）的不同修飾，和不同轉肽酶特異性的不同短氨基酸鏈修飾后的 效應分子，進行結合，從而將至少兩個不同的功能效應分子與多聚體免疫配體結合（圖6)。
[0037] 本申請還公開了用于向免疫配體的N端或C端添加親和性純化和/或檢測標記的 方法，其經過酶介導的轉肽作用，從而能夠借由親和性純化和/或檢測標記的移除，使用親 和性樹脂來截留未完全結合因而仍保留了附加的親和性純化和/或檢測標記的免疫配體， 來選擇效應分子與經修飾的結合蛋白完全（100% )結合的免疫配體（圖4)。
[0038] 本申請還公開了免疫配體，其中轉肽酶催化域直接融合至待結合蛋白的N端或C 端，由此轉肽活性成為待結合的免疫配體的組成部分，在轉肽酶介導的結合反應期間無需 再提供附加的可溶分選酶。
[0039] 所有上述實施例對任何效應分子均可進行位點特異性且化學計量配比受控的免 疫配體結合反應，所述效應分子包括包括小分子毒素（化學實體）、毒性蛋白或熒光標記， 優選為小分子量毒素，所述免疫配體優選地包括抗體；本申請實施例優于使用化學連接子 化學方法將效應分子與蛋白結合的標準化學結合反應，因其無法控制結合比例和位點。因 此，對于制備抗體藥物結合物（ADCs)，使用轉肽酶（優選為分選酶或分裂內含肽）將毒性效 應分子與抗體結合，能夠得到更均一的產物，提高對癌癥治療的預期療效（圖12)。
[0040] 使用分選酶或分裂內含肽進行效應分子與免疫配體的酶促結合，允許效應分子與 蛋白和免疫配體以位點特異性和化學計量配比進行結合，降低了商品成本，并提供了均一 的免疫配體-效應分子結合物，尤其是，轉肽酶的選擇性允許在粗細胞培養上清液中進行 效應分子與免疫配體的結合，且無需像傳統連接子介導的化學結合反應那樣需要純化成 分。因此，使用序列特異性轉肽酶進行效應分子與免疫配體的結合，能夠顯著降低免疫配 體-效應分子商品的成本，尤其是ADC生產。
[0041] 本申請所公開的第一種轉肽酶，即分選酶，已在多種革蘭氏陽性菌中發現，例如葡 萄球菌、鏈球菌和肺炎球菌，且能催化毒力因子與細胞壁蛋白聚酶相連接，從而改變細菌用 于回避被感染宿主免疫應答的表面特征標記（Mazmanian et al. (1999))。革蘭氏陽性菌金 黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的分選酶A (sortase A)首先得到表征（Ton-That et al. (1999))，其后進一步成為多種蛋白修飾中的工具（Tsukiji (2009))。分選酶的吸引 力在于，兩個待結合的分子僅需修飾或表達長度為5個氨基酸的短鏈肽標記（分選酶標記， 對于Staphylococcus aureus分選酶A的情況為LPXTG，其中X為20種天然氨基酸中的任 一種）和優選長度為3-5個氨基酸的甘氨酸鏈（Antos et al. (2009a))，而這些都能容易地 添加到每個分子上，來達成與蛋白N端或C端的結合。該體系可用于兩個蛋白的連接或結 合，也可以用于小分子與蛋白的結合。
[0042] 第二種能得到肽鍵斷裂和形成的轉肽酶成為內含肽，其最初的發現是作為蛋白 內含子，能夠通過斷開肽鍵并形成新的肽鍵，將自身從前體蛋白中移除（剪接）（Xu et al. (1993))(圖2a)。內含肽還能分離為N-內含肽域和C-內含肽域（稱為分裂內含肽）并 連接到后續催化外顯肽域反式剪接的獨立蛋白上。分裂內含肽已被用于N-外顯肽和C-外 顯肽部分的共價連接，以及蛋白的純化和/或環化（Elleuche (2010))。但是，為了將分裂內 含肽也用于小分子效應分子的結合，必須使用的分裂內含肽能夠在N-內含肽域或C-內含 肽域可降為極少氨基酸個數時仍發揮作用，能夠容易地通過化學合成添加到任何大小的分 子上，類似于分選酶介導的轉肽作用所需的優選為3個甘氨酸的短鏈。隨著人造SsP GyrB Sll分裂內含肽的開發，該內含肽中的C-內含肽域僅包含6個氨基酸（Sun et al. (2004))， 該條件得以達成，且該分裂內含肽被用于攜帶生物素的蛋白的C端標記（Volkmann et al. (2009))(圖3a)。類似地，從Ssp DnaX分裂內含肽開發出的長度為11個氨基酸的短 N-內含肽允許蛋白N-端與任何分子結合，只要該11個氨基酸長度的短鏈能夠通過化學合 成添加到所選效應分子上（圖3b)。
[0043] 因此，本申請的一個方面為，將含有Ssp GyrB的6氨基酸C-內含肽域或Ssp DnaX的11氨基酸N-內含肽域、長度優選為3-5個甘氨酸的甘氨酸短鏈或含12個氨基酸 GVFVHNSXXXXX(X為任何天然或人造氨基酸）的氨基酸短鏈，添加到效應分子上，這足以允 許轉肽酶分別將修飾后的效應分子結合到免疫配體上，所述免疫配體分別優選為包含分選 酶識別基序，例如對于使用Staphylococcus aureus分選酶A的情況為LPXTG，或對于使用 Ssp GyrB分裂內含肽的情況為150aa的N-內含肽域，或對于使用Ssp DnaX分裂內含肽的 情況為139aa的C-內含肽域（參見圖1和圖3)。
[0044] 根據分選酶介導的結合反應的需要將氨基酸短鏈（例如3或5個甘氨酸殘基）添 加至小分子量毒素，或根據分裂內含肽介導的結合反應將12個氨基酸的短鏈添加至小分 子量毒素，據發現能夠提高某些疏水毒素分子的水溶性（數據未顯示），由此該氨基酸-毒 素加合物可以在生理性緩沖液中溶解，保證了最優的分解酶或分裂內含肽的結合反應。這 防止了大蛋白分子的結構完整性壓力，尤其是對于接觸到傳統連接子化學和結合相關的有 機溶劑和非生理性PH即容易降解的抗體而言。此外，疏水毒性分子與大蛋白尤其是抗體 的結合，能夠引起某種程度的蛋白聚集。這些也可以通過使用轉肽酶加以改善，尤其是分選 酶，因為其他親水氨基酸停留在酶促生成的結合物中，降低了大蛋白或抗體藥物結合物聚 集的傾向。
[0045]蛋白-蛋白或蛋白-肽連接（Mao et al. (2004)，Parthasarathy et al. (2007) 或TO2011/133704A2)，甚至包括蛋白質環化（Antos et al. (2009b))的現有技術中均 廣泛記載了分選酶。分選酶蛋白或肽連接的應用還包括了使用抗體片段（例如帶蛋白 或肽標記的Fab-和scFv-片段（Mdhlmannet al. (2011)，Madej et al. (2012)，或 US2010/0055761A1和W02012/142659A1))進行的蛋白或肽鏈接。甚至在兩篇已發表的現有 技術文件中，使用分選酶將全長抗體連接到了蛋白上（Levary et al. (2011)，例如EGFP，白 蛋白，白樹毒素被結合到了抗體輕鏈上），或使用分選酶將全長抗體連接到短肽上（Swee et al. (2013))。但是，尚無現有技術文件展示分選酶介導的小分子量毒素（例如阿里他汀或 美登素等）與全長抗體或抗體片段的結合。尤其是，尚無現有技術中公開，如本申請所公開 的，小分子量毒素的ADCs的生成能夠得到小分子量毒素與IgH或IgL鏈（藥物與抗體比例 為2)或與IgH和IgL鏈（藥物與抗體比例為4)均一結合的ADCs。
[0046] 雖然現有技術還公開了，以甘氨酸殘基修飾非蛋白底物，令其可用于簡單的單一 亞基蛋白或肽的分選酶修飾（分別為Tsukiji (2009)或W02007/108013A3)，但對于更具挑 戰性的非蛋白底物（優選為小分子量毒素）與多聚體蛋白（優選為抗體）的均一結合，則 此前尚無記載，雖然事實上，分選酶介導的蛋白或肽連接反應已存在于現有技術中多年。
[0047] 此外，本申請公開了多聚體蛋白的結合，尤其是全長單克隆抗體與2種不同的效 應分子（優選為兩種不同的小分子量毒素）的結合，此前也未記載于現有技術中，雖然分選 酶介導的蛋白或肽連接反應已存在于現有技術中多年（Panowski et al. (2014))。
[0048] 現有技術中已知，分選酶可以接受含有最少3個甘氨酸的底物（Parthasarathy et al. (2007)