抗體制劑的制作方法
【專利說明】抗體制劑
[0001] 本申請是申請日為2008年12月11日、發明名稱為"抗體制劑"的中國專利申請 200880120604. 2 (國際申請號 PCT/EP2008/067293)的分案申請。
[0002] 本發明涉及抗CD20單克隆抗體制劑，制備所述制劑的方法和所述制劑的用途。
[0003] 發明背景
[0004] ⑶20分子（也被稱為B-淋巴細胞-限制性分化抗原或Bp35)是位于前B及成 熟B淋巴細胞上的分子量大約為35kD的疏水性跨膜蛋白（Valentine等人（1989) J. Biol. Chem. 264(19) :11282-11287 和 Einfield 等人（1988)EMB0 J. 7(3) :711-717)。在超過 90% 的來自外周血或淋巴樣器官的B細胞的表面上發現了 CD20,其在早期前B細胞發育過程中 被表達并且一直存在到漿細胞分化。⑶20存在于正常B細胞以及惡性B細胞上。特別地， ⑶20表達于超過90%的B細胞非何杰金氏淋巴瘤（NHL)上（Anderson等人（1984)Blood 63 (6) : 1424-1433)，但是在造血干細胞、原-B細胞、正常漿細胞或其它正常組織上沒有被 發現（Tedder 等人（1985) J, Immunol. 135(2) :973-979) 〇
[0005] CD20蛋白質的85個氨基酸羧基末端區域位于細胞質內。該區域的長度與其它B細 胞-特異性表面結構（如IgM、IgD和IgG重鏈）或者組織相容性Il類抗原α或β鏈形成對 比，其分別具有3、3、28、15和16個氨基酸的相對短的細胞質內區域（Komaromy等人（1983) NARll :6775-6785)。在最后61個羧基末端氨基酸中，21個是酸性殘基，而只有2個是堿性 的，表明該區域具有強的凈負電荷。GenBank登記號是NP-690605。認為⑶20可能參與調節 B細胞激活和分化過程中的早期階段（Tedder等人（1986)Eur. J. Immunol. 2516:881-887) 并能起到鈣離子通道的作用（Tedder等人（1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195)。
[0006] 存在兩種不同類型的抗⑶20抗體，它們的⑶20結合模式和生物活性 明顯不同（Cragg, M. S.，等人，Blood, 103 (2004) 2738-2743 和 Cragg, M. S.，等 人，Blood, 101 (2003) 1045-1051)。I型抗體，如利妥昔單抗（Rituximab)，在補體介導的細 胞毒性方面是有效的，而Π 型抗體，如托西莫單抗（Tositumomab) ( BeXXaF?，BI)、11B8 和AT80,通過具有伴隨的磷脂酰絲氨酸外露的胱天蛋白酶-非依賴性細胞凋亡促使靶細胞 死亡。
[0007] I型和II型抗⑶20抗體的共享的共同特征總結于表1中。
[0008] CN 105126099 A 機切 2/30 頁
[0009] 表1 :Ι型和II型抗⑶20抗體的特性
[0010] 發明概述
[0011] -個方面，本發明涉及藥物制劑，其包含：
[0012] 1 至 150mg/mL 的抗 CD20 抗體；
[0013] 1至IOOmM的緩沖液；
[0014] 任選地0. 001至1 %的表面活性劑；和
[0015] 任選地1至800mM的張度劑；
[0016] pH在4. 5至L 0的范圍內。
[0017] 優選地，所述抗⑶20抗體是II型抗體。更優選地，所述抗⑶20抗體是人源化 B-Lyl抗體。
[0018] 發明詳述
[0019] 術語"抗體"包括各種不同形式的抗體，包括但不限于全抗體、人抗體、人源化抗體 和遺傳基因工程抗體（如單克隆抗體、嵌合抗體或重組抗體）以及此類抗體的片段，只要保 留本發明的特有的特性。
[0020] "抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常至少包括其抗原結合部分或可變區。抗 體片段的實例包括雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素和由抗體片段形成的多特異性抗體。此 外，抗體片段包括具有VH鏈的特征的單鏈多肽，即能與VL鏈裝配在一起或者具有與CD20 抗原結合的VL鏈的特征，即能與VH鏈裝配成功能性抗原結合口袋。
[0021] "抗體片段"還包括這樣的片段，其本身不能提供效應子功能（ADCC/⑶C)，但是能 在與適當的抗體恒定區結合后以根據本發明的方式提供此種功能。
[0022] 本文所用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"指單一氨基酸組成的抗體 分子的制劑。因此，術語"人單克隆抗體"指顯示出單一結合特異性的抗體，其具有來源于 人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區。在一個實施方案中，人單克隆抗體由包括從轉基 因非人動物（如轉基因小鼠）獲得的B細胞的雜交瘤制備，所述雜交瘤具有與無限增殖化 細胞融合的包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組。
[0023] 術語"嵌合抗體"指包含由一個來源或物種得到可變區（即結合區）和從不同來源 或物種得到的至少部分恒定區的單克隆抗體，通常通過重組DNA技術制備。尤其優選包含 鼠可變區和人恒定區的嵌合抗體。此種鼠/人嵌合抗體是免疫球蛋白基因的表達產物，所 述免疫球蛋白基因包含編碼鼠免疫球蛋白可變區的DNA區段和編碼人免疫球蛋白恒定區 的DNA區段。本發明涵蓋的"嵌合抗體"的其它形式是原始抗體的類或亞類經修飾或改變 的形式。此種"嵌合"抗體也稱為"類轉換抗體"。嵌合抗體的制備方法涉及本領域已知的 常規重組DNA和基因轉染技術。參加例如Morrison, S.L.等人，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ;US 5, 202, 238 和 US 5,204,244。
[0024] 術語"人源化抗體"指這樣的抗體，其中構架或"互補決定區"（⑶R)經修飾而包 含特異性不同于親代免疫球蛋白的免疫球蛋白CDR。在一個優選的實施方案中，將鼠 CDR 嫁接到人抗體的構架區內以制備"人源化抗體"。參加例如Riechmann, L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 和 Neuberger, M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。對于嵌合和雙功 能抗體，特別優選的CDR對應于那些識別上述抗原的代表性序列。
[0025] 本文所用的術語"人抗體"意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區 和恒定區的抗體。人抗體是現有技術中公知的（van Dijk, M.A.和van de Winkel, J. G.，Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)。基于此種技術，能制備對抗各種各 樣的祀點的人抗體。人抗體的實例例如描述于Kellermann, S. A.等人，Curr Opin Biotechnol. 13(2002)593-597 中。
[0026] 本文所用的術語"重組人抗體"意欲包括所有通過重組方式制備、表達、產生或分 離的人抗體，例如從宿主細胞（例如NSO或CHO細胞）或從人免疫球蛋白基因的轉基因動 物（例如小鼠）分離的抗體，或采用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體。此種 重組人抗體具有重排形式的源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。本發明的重組 人抗體已經過體內體細胞高變。因此，重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列雖然源自人種 系VH和VL序列并與其相關，卻可以不天然存在于體內人抗體種系庫內。
[0027] 本文所用的"特異性結合"指抗體特異性地與CD20抗原結合。優選地，結合親和 力是 10 9mol/l 或 10 9mol/l 以下（例如 10 ltWiVl)的 KD 值，優選 10 ltWiVl 或 10 ltWil/ 1以下（例如10 12mol/l)的KD值。用標準結合測定法測定結合親和力，例如表面等離振子 共振技術（Biacore?)。
[0028] 本文所用的"核酸分子"意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或 雙鏈，但優選雙鏈DNA。
[0029] "恒定區"不直接參與抗體與抗原的結合，但參與效應功能（ADCC、補體結合和 CDC) 〇
[0030] 本文所用的"可變區"（輕鏈可變區（VL)、重鏈可變區（VH))指直接參與抗體抗原 結合的每一對輕鏈和重鏈。人輕鏈和重鏈的可變區具有相同的一般結構，每個區域包含四 個構架（FR)區，其序列廣泛保守，由三個"超變區"（或互補決定區，⑶R)連接。構架區采 取b-片層構象，CDR可形成連接b-片層結構的環。每條鏈中的CDR通過構架區保持其三 維結構并與另一條鏈的CDR -起形成抗原結合位點。抗體重鏈和輕鏈CDR3區在根據本發 明的抗體結合特異性/親和力中發揮重要的作用，因而提供了本發明的另一個目的。
[0031] 當用于本文時術語"超變區"或"抗體的抗原結合部分"指抗體中負責抗原結合的 氨基酸殘基。超變區包含"互補決定區"或"⑶R"的氨基酸殘基。"構架"區或"FR"區是 除了本文所定義的超變區殘基之外的那些可變區區域。因此，抗體的重鏈和輕鏈從N-端 到C-端包含區域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。尤其是，重鏈的CDR3是對抗原 結合作出最大貢獻的區域。根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學重要的蛋白質序列），第五版.公共衛生服務處，國家衛生部，貝塞斯 達，馬里蘭州.（1991))的標準定義和/或那些來自"超變環"的殘基確定⑶R區和FR區。
[0032] 本文可互換使用術語"⑶20"和"⑶20抗原"，并且其包括人⑶20的任何變體、同 種型和種同源物，其由細胞天然表達或表達于用CD20基因轉染的細胞上。本發明的抗體和 CD20抗原的結合通過失活CD20來介導殺死表達CD20的細胞（例如腫瘤細胞）。殺死表達 ⑶20的細胞可通過以下一種或多種機理發生：
[0033] 現有技術已確認的⑶20的同義詞包括B-淋巴細胞抗原⑶20、B-淋巴細胞表面抗 原 BK Leu-16、Bp35、BM5 和 LF5。
[0034] 根據本發明的術語"抗CD20抗體"是特異性結合CD20抗原的抗體。取決 于抗⑶20抗體對⑶20抗原的結合特性和生物活性，根據Cragg，M. S.等人，Blood 103 (2004) 2738-2743 和 Cragg, Μ· S.等人，Blood 101 (2003) 1045-1051 能將抗 CD20 抗體區 分為兩種類型，見表2。
[0036] 表2 :1型和II型抗⑶20抗體的特性
[0037] I型和II型抗⑶20抗體的一個重要特性是它們的結合模式。因此可通過所述抗 CD20抗體相對于利妥昔單抗對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)上的CD20的結合能力的比率 對I型和II型抗⑶20抗體進行分類。
[0038] 如本文所用的，"抗⑶20抗體"可以是I型或II型抗體。優選地，它是II型抗體。
[0039] 所述I型抗CD20抗體相對于利妥昔單抗對Ra j i細胞（ATCC-No. CCL-86)上 的⑶20的結合能力的比率為0.8至1.2、優選0.9至1. 1。此種I型抗⑶20抗體的實 例包括例如利妥昔單抗、（W094/11026)、1F5 IgG2a(ECACC，雜交瘤；Press等人，Blood 69/2:584-591 (1987) )，HI47 IgG3(ECACC,雜交瘤），2C6 IgGl (如 W02005/103081 中公 開的），2F2 IgGl (如公開的及 WO 2004/035607 和 W02005/103081)和 2H7 IgGl (如 WO 2004/056312中公開的）。優選地所述I型抗CD20抗體是與利妥昔單抗結合相同的表位 的單克隆抗體。所述Π 型抗⑶20抗體相對于利妥昔單抗對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86) 上的⑶20的結合能力的比率為0. 3至0. 6,優選0. 35至0. 55,更優選0. 4至0. 5。此種 II型抗⑶20抗體的實例包括例如托西莫單抗（BI IgG2a)、人源化B-Lyl抗體IgGl (如 TO2005/044859中公開的嵌合人源化IgGl抗體）、llB8IgGl (如WO 2004/035607中公開的） 和AT80IgGl。優選地所述II型抗⑶20抗體是與人源化B-Ly 1抗體結合相同的表位的單克 隆抗體（如W02005/044859中公開的）。
[0040] 使用所述綴合Cy5的抗CD20抗體和綴合Cy5的利妥昔單抗在FACSArray (Becton Dickinson)中用Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)通過直接免疫熒光測定（測定平均熒光強度 (MFI))確定"抗CD20抗體相對于利妥昔單抗對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)上的CD20的 結合能力的比率"，如實施例2中所述，并且如下計算：
[0041] 對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)上的CD20的結合能力的比率=
[0043] MFI是平均熒光強度。如本文所用的"Cy5標記比率"意指每分子抗體Cy5標記分 子的數量。
[0044] 所述第一抗⑶20抗體相對于利妥昔單抗對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)上的 ⑶20的結合能力的比率，典型地所述I型抗⑶20抗體為0. 8至1. 2,優選0. 9至1. 1。
[0045] 所述第二抗⑶20抗體相對于利妥昔單抗對Raji細胞（ATCC-No. CCL-86)上的 ⑶